Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
β-Amplifikation (für 100 Reaktionen):
10x PCR Puffer (Boeringer) 200 µl
dH2O 1635 µl
dNTP (10mM) 20 µl
Vβ X for in (100pmol/µl) 10 µl
Pat Y β rev in (100pmol/µl) 10 µl
Taq DNA Polymerase (Boeringer) 25 µl
1900 µl
Die PCR-Ansätze wurden anschließend auf einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt und die
erhaltenen DNA-Fragmente durch Sequenzieren (II.2.9) überprüft. Nur die Zellen, die die
korrekte TZR-β-Kette zeigten, wurden dann in die α-PCR-Reaktion eingesetzt. Aufgrund der
großen Menge an Primern, die für die Amplifikation aller theoretisch möglichen TZR-α-
Ketten benötigt wurden, wurden für jede positive β-Kette fünf Einzelreaktionen durchgeführt.
Jede Einzelreaktion enthielt ein Vα-Primer Set a-e mit je 7-8 Vα-Primern. Hierzu wurden
erneut je 1µl des Reaktionsgemisches aus der αβ-Voramplifikation mit 19µl PCR-Mix
gemischt und mit demselben PCR-Programm analysiert.
α-Amplifikation (für 15 Reaktionen):
10x PCR Puffer (Boeringer) 30,0 µl
dH2O 232,5 µl
dNTP (10mM) 3,0 µl
Cα rev in (100pmol/µl) 1,5 µl
Vα Primer Set a, b, c, d oder e 15,0 µl
Taq DNA Polymerase (Boeringer) 3,0 µl
285,0 µl
Anschließend wurden die PCR-Ansätze auf einem Gel analysiert und auftretende DNA-
Banden ebenfalls sequenziert.
2.8 Klonierung
2.8.1 Schneiden der DNA mit Restriktionsendodukleasen
Restriktionsenzyme sind Endonukleasen, die spezifische Basensequenzen in einer DNA-
Doppelhelix erkennen und beide Stränge der Helix an spezifischen Stellen schneiden. Dadurch
werden Phosphodiesterbindungen gelöst.
Die Spaltung von DNA in wässrigen Lösungen wurde in den vom Hersteller empfohlenen
Pufferlösungen und unter den empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Die meisten
38