Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
PCR-Programm:
1. 1x 94°C 6min
2. 40x [94°C, 59°C, 72°C] jeweils 1min
3. 1x 72°C 7min
Anschließend wurden die Produkte geteilt und in eine zweite PCR-Reaktion („run off“-
Reaktion) mit jeweils 13 verschiedenen, fluoreszenzmarkierten, Jβ-spezifischen Primern
eingesetzt.
Reaktionsansatz zweite PCR Runde „run off“:
PCR-Produkt aus erster Runde 2,0 µl
10x PCR-Puffer (mit 15mM MgCl2) 1,0 µl
dNTP (20mM) 0,1 µl
Jβ-Primer, fluoreszenzmarkiert, jeweils 5,0 µl
Taq Polymerase 0,04 µl
H2O 1,86 µl
10,0 µl
PCR-Programm:
1. 94°C 10min
2. 94°C 1min
3. 59°C 1min
4. 72°C 10min
Die Schritte 2-4 werden 5x wiederholt.
Die erhaltenen Produkte unterschiedlicher Länge wurden nun mithilfe des ABI 377 Sequenzers
der Firma Applied Biosystems und einem hochauflösenden Polyacrylamidgel aufgetrennt und
mit dem Programm Genescan 3.1.2 der Firma Applied Biosystems analysiert.
Ist eine TZR-β-Kette einer betrachteten Subfamilie polyklonal im Patienten vorhanden, stellen
die Längen der einzelnen Vβ-Jβ-PCR-Produkte eine Gauss’sche Normalverteilung dar. Bei
einer monoklonalen Expansion ist ein eindeutiger Peak im Spektratype erkennbar, was auf ein
stark dominierendes Produkt definierter Länge hindeutet. Um die Monoklonalität eindeutig zu
beweisen, wurden solche Peaks durch Sequenzierung nochmals analysiert. Das Schema eines
solchen CDR3-Spektratyps ist in Abb. 8 dargestellt.
42