Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg
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II. Material <strong>und</strong> Methoden<br />
Die DNA-Konzentration wurde anschließend mit Hilfe des Spektrophotometers GeneQuant II<br />
wie unter II.2.3.3 beschrieben bestimmt.<br />
2.3.2 Isolierung von Plasmid-DNA für analytische Zwecke<br />
Die Isolierung von Plasmid-DNA für analytische Untersuchungen erfolgte entweder mit Hilfe<br />
des GFX TM Mikro Plasmid Prep Kit von Amersham Pharmacia oder des QIAprep Spin<br />
Miniprep Kit von QIAGEN.<br />
Für den GFX TM Mikro Plasmid Prep Kit wurden 3ml LB-Medium, das mit dem<br />
entsprechenden Antibiotikum versetzt wurde, mit einer isolierten Bakterienkolonie angeimpft<br />
<strong>und</strong> über Nacht bei 37°C im Schüttler inkubiert. Am nächsten Tag wurden 2ml der<br />
herangewachsenen Bakterienkultur in ein 2ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt <strong>und</strong> die<br />
Bakterien durch Zentrifugieren für 30sec bei 14.000rpm sedimentiert. Das Bakteriensediment<br />
wurde in 150µl Lösung 1 durch Vortexen resuspendiert <strong>und</strong> die Bakterien anschließend durch<br />
150µl Lösung 2 lysiert. Nach Zugabe von 300µl Lösung 3 wurde das Gemisch 5min bei<br />
14.000rpm zentrifugiert, um die präzipitierten Bestandteile abzutrennen <strong>und</strong> der Überstand auf<br />
eine GFX-Säule überführt. Nach einminütiger Inkubation bei RT wurde die Säule 30sec bei<br />
14.000rpm zentrifugiert <strong>und</strong> anschließend mit 400µl Waschpuffer gewaschen. Nach erneuter<br />
Zentrifugation wurde die an die Säulenmembran geb<strong>und</strong>ene Plasmid-DNA mit 50-100µl EB-<br />
Puffer in ein frisches Eppendorf-Reaktionsgefäß eluiert. Um eine vollständige Elution der<br />
DNA zu gewährleisten, wurde die Säule vor dem abschließenden Zentrifugationsschritt 1min<br />
bei RT inkubiert.<br />
Die DNA-Konzentration wurde anschließend mit Hilfe des Spektrophotometers GeneQuant II<br />
wie nachfolgend beschrieben bestimmt.<br />
Die Isolierung der Plasmid-DNA mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit von QIAGEN<br />
erfolgte auf ähnliche Art <strong>und</strong> Weise. Nach Abzentrifugieren von 2ml angezüchteter<br />
Bakterienkultur wurde das Bakteriensediment in 250µl Resuspensionspuffer P1 gelöst,<br />
anschließend mit 250µl Lysispuffer P2 versetzt <strong>und</strong> nach vorsichtigem Invertieren mit 350µl<br />
Neutralisationspuffer N3 gemischt. Die Bakterienbestandteile wurden nun 10min bei<br />
13.000rpm sedimentiert, der Überstand auf eine Säule gegeben <strong>und</strong> erneut zentrifugiert. Nach<br />
Waschen der Säule mit 500µl PE Puffer <strong>und</strong> 750µl PB Puffer wurde die DNA mit 50µl EB-<br />
Puffer eluiert <strong>und</strong> die Konzentration mit Hilfe des Spektrophotometers bestimmt.<br />
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