Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
Lasermikrodissektion aus Gewebe zu isolieren. Deshalb wurde diese Methode zunächst dazu
verwendet, sich einen Überblick über die Menge und Verteilung der T-Zellen im Gewebe zu
verschaffen. Außerdem konnten durch die Fluoreszenzfärbung zwei Oberflächenmoleküle
derselben T-Zelle gleichzeitig angefärbt werden, was mit der AP-Färbung nicht möglich war.
Die Gewebeschnitte wurden wie in II.3.1 beschrieben auf Objektträger ohne Folie aufgebracht
und nach 20 minütiger Fixierung mit 4% Paraformaldehyd gründlich in PBS gewaschen. Nach
Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen für 20min mit 2% Ziegenserum/2% BSA in
PBS wurden die Schnitte 40min mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach dreimaligem
Waschen mit PBS wurde der fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper für 30min auf das
Gewebe aufgebracht. Bei einer Doppelfärbung wurde der direkt markierte AK erst im zweiten
Färbeschritt gemeinsam mit dem sekundären AK eingesetzt. Nach erneutem Waschen mit PBS
wurde der Schnitt mit einem speziellen Eindeckmedium von DAKO eingebettet und unter dem
Mikroskop ausgewertet.
Färbeprotokoll zur Isolation von T-Zellen aus Gewebe
Nachdem ein neues Lasermikrodissektionsgerätes gekauft wurde, war es möglich, auch
fluoreszenzgefärbte Zellen aus Geweben zu isolieren. Hierzu musste das Färbeprotokoll
geringfügig geändert werden.
Die Schnitte wurden auf Folienobjektträger aufgebracht und ohne Fixierung direkt in die
Färbung eingesetzt. Nach Absättigung mit 2% Ziegenserum/2% BSA in PBS wurden die
Schnitte mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach Waschen des Gewebes mit PBS wurde ein
sekundärer AK und bei Bedarf ein direkt markierter AK auf den Schnitt aufgebracht. Nach
erneutem Waschen wurden die Muskelgewebeschnitte mit Ethanol abgespült, getrocknet und
zum Schneiden verwendet. Das Hirngewebe hingegen wurde mit PBS beschichtet und im
feuchten Zustand nach positiven Zellen durchsucht. Nach Trocknen des Gewebes erfolgte auch
hier die Isolation der Zellen. Der Grund für die Suche nach Zellen im feuchten Präparat ist die
enorme Eigenfluoreszenz des trockenen Hirngewebes. Zur Bewahrung der RNA wurden, wie
auch in der AP-Färbung, alle Inkubationslösungen mit 3% Prime RNAse Inhibitor (Eppendorf)
versetzt.
Kurzfärbeprotokoll
Um die RNA noch effektiver zu erhalten, wurde durch die Kollegin Jana Ivanidze ein
Kurzprotokoll etabliert, welches im Rahmen dieser Arbeit zur Färbung der Hirnbiopsie
angewandt wurde. Hierzu wurden die Gewebsschnitte nach kurzer Beschichtung mit PBS 3min
mit 2% BSA in PBS inkubiert. Nach der Absättigung wurden die Schnitte 5min mit dem AK,
verdünnt in 2% BSA in PBS, inkubiert und anschließend dreimal mit PBS gespült. Im Falle
eines sekundären AK erfolgte eine erneute 3minütige Inkubation. Nach dem Abspülen wurde
das Gewebe mit 1-Propanol überschichtet und unter dem Mikroskop nach positiven Zellen
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