Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
Standard PCR-Programm:
Schritt Temperatur [°C] Dauer [min]
1. Anfangsdenaturierung 95 2
2. Denaturierung 95 1
3. Annealing abhängig von den Primerpaaren 1
4. Elongation 72 abhängig von der
Produktgröße
5. Auffüllen 72 10
Schritte 2-4 wurden 25-30x wiederholt.
2.7.2 In-vitro-Mutagenese über PCR
Die PCR-Reaktion wurde in einigen Fällen dazu benutzt, Nukleotidsequenzen gezielt zu
verändern und so in die amplifizierte DNA-Sequenz stille Mutationen einzufügen. Durch
dieses Verfahren konnten neue Restriktionsschnittstellen in die DNA-Sequenz eingefügt oder
gezielt vorhandene Restriktionsschnittstellen zerstört werden. Die Aminosäureabfolge, die
durch diese Sequenz kodiert wurde, wurde dabei jedoch nicht verändert. Die hierzu
eingesetzten Oligonukleotide waren größtenteils mit der Zielsequenz komplementär, nur
ausgewählte Nukleotide wurden verändert.
2.7.3 Einzelzell-RT-PCR
Eine in dieser Arbeit entwickelte Sonderform der PCR stellt die Einzelzell-RT-PCR dar. Diese
wurde dazu verwendet, spezifisch die DNA der beiden T-Zell-Rezeptor-Ketten einer einzelnen
T-Zelle, zu analysieren. Hierzu wurde das Qiagen One-Step-RT-PCR-Kit verwendet.
Zur Analyse wurden Zellen eingesetzt, die mittels Lasermikrodissektion (II.3.4) aus
Biopsiematerial oder Cytospins (II.3.2) isoliert wurden. Die Einzelzell-RT-PCR erfolgte in vier
Teilreaktionen. In der RT-Reaktion wurde die mRNA der isolierten Zelle zunächst in cDNA
umgeschrieben und anschließend in einer ersten Amplifikationsrunde beide Ketten des T-Zell-
Rezeptors (TZR) voramplifiziert. In der zweiten Amplifikationsrunde wurde zunächst nur die
β-Kette des TZR amplifiziert und nur die β-positiven Proben weiter auf eine mögliche α-Kette
untersucht.
Da sich die Zellen nach der Isolation mittels Lasermikrodissektion im Deckel des PCR-
Reaktionsgefäß befanden, wurden je 20µl RT-Reaktionsmix für die RT-Reaktion in den
Deckel pipettiert und durch Zentrifugation in das Reaktionsgefäß gebracht. Die Proben wurden
30min bei 50°C in einem PCR-Thermocycler inkubiert.
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