Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
RT-Reaktionsmix (für 100 Reaktionen):
5x Qiagen One-Step-RT-PCR Puffer 400,0 µl
H2O RNAse frei (Qiagen) 1405,0 µl
RNase out (Invitrogen) 10,0 µl
dNTP (10mM, Qiagen) 80,0 µl
Cα RT (100pmol/µl) 12,5 µl
Cβ RT (100pmol/µl) 12,5 µl
Qiagen One-Step-RT-PCR Enzyme Mix 80,0 µl
2000,0 µl
Anschließend wurden 5µl Reaktionsmix für die αβ-Voramplifikation direkt zur RT-Reaktion
gegeben und erneut im PCR-Thermocycler inkubiert.
αβ-Voramplifikation (für 100 Reaktionen):
5x Qiagen One-Step-RT-PCR Puffer 100 µl
H2O RNAse frei (Qiagen) 270 µl
dNTP (10mM, Qiagen) 20 µl
Cα rev out (100pmol/µl) 15 µl
Vα pool gesamt 45 µl
Vβ X for out (100pmol/µl) 15 µl
Pat Y β rev out (100pmol/µl) 15 µl
Qiagen One-Step-RT-PCR Enzyme Mix 20 µl
500 µl
PCR-Programm:
1. 94°C 2min
2. 4x [94°C, 61°C, 72°C] jeweils 1min
3. 4x [94°C, 58°C, 72°C] jeweils 1min
4. 4x [94°C, 56°C, 72°C] jeweils 1min
5. 40x [94°C, 53°C, 72°C] jeweils 1min
6. 72°C 10min
Ohne eine Analyse auf dem Agarosegel wurde je 1µl des Reaktionsgemisches in die
nachfolgende β-PCR-Reaktion eingesetzt. Bei dieser Reaktion handelte es sich um eine
doppel-nested PCR, da beide Primer für die β-Ketten innerhalb der Primer der αβ-
Voramplifikation lagen. Es wurden jeweils 19µl Reaktionsgemisch mit 1µl der αβ-
Voramplifikation versetzt und mit dem gleichen PCR-Programm amplifiziert.
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