Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
Genicitin 418 100 mg/ml Endkonz. 1,5mg/ml
Hygromycin B 50 mg/ml Endkonz. 0,3mg/ml
Puromycin 1 mg/ml Endkonz. 1,0µg/ml
4.2 Kultivierung von adhärent wachsenden Zellen
Die adhärent wachsenden Maus-Fibroblasten-Zellen LTK - , die menschliche
Rhabdomyosarkom Zelllinie TE671 sowie die Verpackungszelllinie GP+E 86 wurden als
Monolayer-Kultur in Zell-Kulturschalen oder -flaschen gehalten. Als Grundmedium diente das
in Punkt II.1.10 aufgeführte RPMI1640 mit den entsprechenden Zusätzen.
Nach der Transfektion der LTK - - bzw. der TE671-Zellen mit verschiedenen HLA-Molekülen
wurden die Zellen durch Antibiotika auf Selektionsdruck gehalten.
Bei einer Konfluenz von etwa 90% wurden die Zellen nach einmaligem Waschen mit PBS
durch Trypsin-EDTA abgelöst und dieses mit Medium inaktiviert. Nach Zentrifugation und
Aufnahme der Zellen in frischem Medium wurde ein Teil der Zellen in eine neue Kulturschale
oder -flasche ausgebracht.
Genicitin 418 100 mg/ml Endkonz. 0,3mg/ml L-Zellen
Endkonz. 0,75mg/ml TE671
Puromycin 1 mg/ml Endkonz. 3µg/ml GP+E 86
4.3 Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zellzahl vor Transfektionen oder Peptid-Library-Experimenten konnte
die Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Zählkammer bestimmt werden. Je nach Zelldichte wurden
die Zellen 1:1 oder 1:10 in einer Trypanblau-Lösung (1:3 in PBS) verdünnt und in die
Zählkammer eingebracht. Tote Zellen erschienen im Mikroskop dunkel gefärbt, da sie den
Farbstoff aufgrund von Zellmembrandefekten aufnahmen und wurden beim Zählen nicht
berücksichtigt. Nach Auszählen der vier Quadranten berechnete sich die Konzentration der
Zellen in der ursprünglichen Suspension nach folgender Formel:
c = Durchschnittliche Anzahl der Zellen pro Quadrant x Verdünnung x 10 4 / ml.
4.4 Einfrieren und Auftauen von Zellen
Die einzufrierenden Zellen wurden 10min bei 1200rpm zentrifugiert, in 1,5ml Einfriermedium
(10% DMSO in FKS) aufgenommen und in Einfrierröhrchen überführt. Anschließend wurden
die Röhrchen in einer mit Isopropanol gefüllte Einfrierbox bei -80°C langsam eingefroren und
nach 2-3 Tagen in flüssigen Stickstoff überführt und dort gelagert.
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