Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
2.2.2 Elektroporation
Die für die Elektroporation hergestellten Bakterien DH5αF’IQ wurden 10min auf Eis
aufgetaut. Anschließend wurden 1-2µl Plasmid-DNA zu den Bakterien pipettiert, in eine
vorgekühlte Transformationsküvette (0,2cm von BioRad) überführt und mit 2,5kV, 200Ω,
25µF elektroporiert. Hierdurch öffnen sich Poren in den Bakterienzellwänden durch die die
DNA in die Zelle eindringen kann. Die Zellsuspension wurde mit 1ml LB-Medium ohne
Antibiotikum verdünnt und in ein Falcon überführt. Nach einer Inkubation von 30min bis 1h
bei 37°C im Schüttler wurden 20µl, 50µl bzw. 200µl der elektroporierten Bakterienzellen auf
LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37°C im
Wärmeschrank inkubiert.
2.3 Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen
2.3.1 Isolierung von Plasmid-DNA im präparativen Maßstab
Die Isolierung von Plasmid-DNA im präparativen Maßstab erfolgte mit dem Qiagen Maxi-Kit.
Hierzu wurden 250ml antibiotikahaltiges LB-Medium mit Bakterien von einer Agarplatte oder
einer Glycerinkultur angeimpft und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde
die Bakteriensuspension 10min bei 5000rpm und 4°C abzentrifugiert und das Sediment in
10ml Resuspensionspuffer P1 resuspendiert. Anschließend wurden 10ml Lysispuffer P2
hinzugefügt und nach vorsichtigem Invertieren 5min bei RT inkubiert, um eine vollständige
Lyse der Bakterienzellen zu gewährleisten. Nach Zugabe von 10ml Neutralisationspuffer P3
und vorsichtigem Invertieren, wurde das Gemisch 30min auf Eis oder im Kühlschrank
inkubiert. Das Abtrennen der nun lysierten Bakterien erfolgte durch 30minütiges
Zentrifugieren bei 10.000rpm und 4°C. Der Überstand, der die gewünschte Plasmid-DNA
enthielt, wurde nun auf eine vorher mit Puffer QBT äquilibrierte Qiagen-Säule überführt. Die
DNA bindet beim Durchlauf an die Säulenmembran. Zum Waschen der Plasmid-DNA wurden
zweimal je 30ml des Waschpuffers QC auf die Säule gegeben und anschließend die DNA mit
15ml Elutionspuffer QF in ein Glaszentrifugationsröhrchen eluiert. Zur Präzipitation der DNA
wurden 11ml Isopropanol zugegeben und gut gemischt. Nach anschließender Zentrifugation
für 30min bei 10.000rpm und 4°C wurde die DNA mit 80% Ethanol gewaschen und erneut
15min zentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes und Trocknen des DNA-Sediments
wurde diese in 200µl EB-Puffer resuspendiert. Um eine ausreichende Sauberkeit der DNA zu
gewährleisten, wurde die DNA nach dem Lösen nochmals 5min bei 14.000rpm zentrifugiert
und der Überstand in ein frisches Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.
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