Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg
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III. Ergebnisse<br />
Abb. 20: Analyse der TZR-β-Kette isolierter COP-1-Einzelzellen mit Einzelzell-PCR<br />
Dargestellt ist eine Auswahl analysierter COP-1-Einzelzellen. Die isolierten Zellen wurden mit<br />
klonspezifischen Primern gegen die Vβ17-Jβ2.3-TZR-Kette untersucht. Das erwartete PCR-Produkt wies<br />
eine Größe von 150bp auf. Die Spuren 1,5,8,9,11-14 <strong>und</strong> 16 zeigen eine Bande in der richtigen Höhe.<br />
Spur M: 100bp-DNA-Marker<br />
Spur 1-16: mit Einzelzell-PCR analysierte COP-1 Einzelzellen<br />
Wir überprüften die amplifizierte Sequenz entweder durch Sequenzierung oder durch einen<br />
Testverdau mit dem Restriktionsenzym HindIII (Abb. 21). Das Enzym trennt ca. 14bp des<br />
amplifizierten PCR-Produkts ab, sodass nur ein geringer Shift auf dem Agarosegelbild zu<br />
erkennen ist.<br />
Abb. 21: Überprüfung der Vβ17-PCR-Produkte der analysierten COP-1-Einzelzellen durch<br />
einen HindIII-Restriktionsverdau <strong>und</strong> die dazugehörige Nukleotidsequenz<br />
Die PCR-Produkte der durch die β-PCR analysierten COP-1-Einzelzellen wurden durch einen<br />
Restriktionsverdau mit HindIII auf ihre Richtigkeit überprüft. Das korrekt verdaute PCR-Produkt zeigt einen<br />
kleinen Schift nach unten im Vergleich zur unverdauten Kontrolle.<br />
Spur M: 100bp-DNA-Marker<br />
Spur 1-8: mit HindIII verdaute Vβ17-PCR-Produkte der analysierten COP-1-Einzelzellen<br />
Spur 9: unverdaute Kontrolle<br />
Die Nukleotidsequenz zeigt einen Ausschnitt der Vβ17-Kette der COP-1-Zellen mit der verwendeten HindIII-<br />
Schnittstelle.<br />
Die Amplifikation der TZR-α-Kette mit den universellen Primer Sets lieferte ein Signal in den<br />
Sets c <strong>und</strong> d (Abb. 22a). Dies ist durchaus möglich, da durch die große Anzahl eingesetzter<br />
Primer <strong>und</strong> durch die Ähnlichkeit der Primer untereinander die gleiche Sequenz von zwei<br />
verschiedenen Primern amplifiziert werden kann. Die PCR-Produkte wurden ebenfalls<br />
entweder durch Sequenzierung oder durch Restriktionsverdau mit SmaI auf ihre Richtigkeit<br />
überprüft. Der SmaI-Verdau der TZR-α-Kette spaltet das PCR-Produkt in ein 110bp sowie ein<br />
50bp großes Fragment (Abb. 22b).<br />
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