Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
2.1 Färbung und Isolierung expandierter Einzelzellen aus
Muskelgewebe der Myositispatienten PM16488 sowie IBM15551
Von beiden ausgewählten Myositisbiopsien haben wir, wie unter II.3.1 beschrieben, 10µm
dicke Gefrierschnitte auf Objektträger aufgebracht. Die Vβ-Region des TZR wurde mit dem
entsprechenden AK gefärbt und die positiven Zellen durch Lasermikrodissektion aus dem
Gewebe isoliert. Die zur Isolation geeigneten T-Zellen mussten eine der nachfolgenden
morphologischen Kriterien erfüllen. Entweder mussten sie in engem physikalischen Kontakt
mit der Muskelfibrille stehen, eine kappenartige Struktur auf der Muskelfibrille ausbilden oder
die Muskelzelle invadieren. Nur bei solchen Zellen konnte man davon ausgehen, dass sie aktiv
an der Erkrankung beteiligt sind, diese vielleicht sogar auslösen. Alle anderen Zellen, sog.
„bystander-Zellen“, wurden nicht berücksichtigt, da sie möglicherweise nur durch
entzündungsbedingte Cytokinausschüttung angelockt wurden und nicht aktiv an der
Pathogenese beteiligt sind. Außerdem durfte die Zielzelle nicht im Verband mit anderen Zellen
vorliegen, um so die Isolation einer einzelnen Zelle zu gewährleisten.
2.1.1 Immunhistochemische
Muskelgewebe
Vorversuche auf Tonsillen- und
Bevor die Färbung auf Biopsiegewebe durchgeführt werden konnte, mussten wir zunächst die
optimale Konzentration der verwendeten AK ermitteln. Hierfür wurde Tonsillengewebe
verwendet, da dies reich an Lymphozyten ist. Später wurde das Ergebnis auf Muskelgewebe
bestätigt. Wir führten sowohl Fluoreszenzfärbungen als auch Färbungen mit alkalischer
Phosphatase (AP) durch. Anfangs, d.h. bei der Analyse der Patienten PM16488 sowie
IBM15551, wurde die Fluoreszenzfärbung lediglich dafür benutzt, einen Überblick über die
Menge und Verteilung der T-Lymphozyten in der Muskelbiopsie zu erhalten. Die
anschließende Isolation von Zellen erfolgte aus AP-gefärbten Schnitten, da zu diesem
Zeitpunkt die Mikrodissektion von Zellen fluoreszenzgefärbter Präparate noch nicht möglich
war. Während der Analyse des MS-Patienten FE konnten auch fluoreszenzgefärbte Zellen
durch ein neues Lasermikrodissektionsgerät isoliert werden. Somit trat die AP-Färbung in den
Hintergrund.
Zur AK-Testfärbung brachten wir Tonsillenschnitte mit einer Dicke von 10µm auf
Glasobjektträger auf und färbten diese mit einem AK gegen die Vβ1-Region des TZR sowie
einem AK gegen das menschliche CD8-Molekül. Der CD8-AK war direkt mit dem FITC-
Farbstoff gekoppelt, der unmarkierte Vβ1-AK musste mit einem Cy3-gekoppelten sekundären
AK sichtbar gemacht werden. Die Präparate wurden nach der Färbung mit einem Deckglas
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