Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
abgesucht. Nach dem Verdampfen des 1-Propanols konnten die markierten Zellen isoliert
werden. Zum Schutz der RNA wurde 2,5% Protector RNAse Inhibitor (Roche) zu allen
Inkubationslösungen hinzugegeben.
3.4 Lasermikrodissektion
Die gefärbten Gewebeschnitte konnten direkt zur Lasermikrodissektion eingesetzt werden.
Die beiden hierfür verwendeten Mikroskope waren mit einem Laser gekoppelt und der
Objekttisch durch den Rechner steuerbar. Dies ermöglichte ein exaktes Bewegen des
Objektträgers. Die Bilddaten wurden mittels einer Farb-CCD-Kamera an den Bildschirm
übertragen.
Nach Justieren des Mikroskops und des PCR-Reaktionsgefäßes, wurde ein Objektträger in den
Objekttisch eingelegt und das Gewebe systematisch nach gefärbten Zellen abgesucht. Die
detektierten Zellen wurden fotografiert und der Schneideweg des Lasers vorgegeben. Der
Schneidevorgang selbst lief automatisch ab und konnte am Bildschirm verfolgt werden. Mit
einem einzelnen gezielten Laserschuss wurde die Zelle aus dem Gewebe katapultiert. Die Zelle
wurde im Deckel eines 200µl PCR-Reaktionsgefäßes aufgefangen, das zuvor in einer
speziellen Halterung über dem Objektträger montiert wurde. Die Deckelinnenseite wurde mit
Mineralöl bestrichen, um ein Anhaften der Zelle zu gewährleisten. Die katapultierten Zellen
wurden auf Trockeneis gesammelt und anschließend bis zur PCR-Analyse bei -80°C gelagert.
Das entstandene Loch im Gewebeverband wurde ebenfalls durch ein Foto dokumentiert.
4. Zellbiologische Methoden
4.1 Kultivierung von Suspensionszellen
Die Zellen des Maus-T-Zell-Hybridoms 58α - β - sowie die durch EBV immortalisierten B-
Zellen des Patienten 16488 wurden in Suspensionskulturen gehalten. Als Grundmedium diente
für beide Zelllinien das RPMI1640, das mit FKS, Penicillin/Streptomycin, non essential
aminoacids sowie Natrium Pyruvat in den oben aufgeführten Konzentrationen versetzt wurde
(II.1.10).
Die mit beiden TZR-Ketten sowie mit dem CD8-Corezeptor transfizierten 58α - β - Zellen
wurden zusätzlich durch Zugabe entsprechender Mengen von Antibiotika auf dem nötigen
Selektionsdruck gehalten.
Bei einer entsprechenden Zelldichte wurde ein Teil der Zellen verworfen, die restlichen Zellen
mit frischem Medium verdünnt.
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