Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
Als APZs wurden entweder die mit EBV immortalisierten B-Zellen des zu untersuchenden
Patienten oder die Maus-Fibroblastenzelllinie verwendet. Der Vorteil der autologen EBV-B-
Zellen ist, dass sie von sich aus bereits alle patientenspezifischen HLA-Moleküle auf der
Zelloberfläche exprimieren. In die LTK-Zellen mussten diese zuvor hineintransfiziert werden.
Am Versuchstag wurden 2x10 5 EBV-B-Zellen in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte ausgebracht.
Die LTK-Zellen (3x10 4 /well) wurden bereits einen Tag zuvor ausgebracht, um eine
vollständige Adhärenz zu gewährleisten. Anschließend wurde der Peptidmix in einer
Konzentration von 100ng/ml zugeben und für 4-6 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Anschließend wurden 4x10 4 Maus-Hybridomzellen, die mit dem entsprechenden TZR
transfiziert waren, zugegeben und 13-16 Stunden bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde
die IL-2-Konzentration der Überstände im IL-2-ELISA gemessen. Als Positiv-Kontrolle wurde
parallel eine Aktivierung mit einem AK gegen das murine CD3-Molekül durchgeführt.
4.10 Interleukin 2-ELISA
Mit Hilfe des IL-2-ELISAs wurde die Menge an IL-2, die nach Aktivierung der Maus-
Hybridome ausgeschüttet wurde, gemessen. Hierfür wurde das Mouse IL-2 ELISA Ready-
SET-Go Kit von eBioscience verwendet.
Am Vortag des Versuchs wurde eine entsprechende Anzahl an 96-Loch-Maxisorb-
Mikrotiterplatten (Nunc) mit je 50µl Capture-AK (1:250 in 1x Coating-Puffer) beschichtet und
über Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden nach dreimaligem Waschen mit
Waschpuffer (0,05% Tween 20 in PBS) die vorbereiteten Platten mit je 200µl 1x Assay-diluent
abgesättigt und eine Stunde bei RT inkubiert. Nach erneutem Waschen erfolgte eine
zweistündige Inkubation mit je 100µl IL-2-Überstand. Zur Kontrolle des Versuchs wurde ein
in 1x Assay-diluent verdünnter IL-2-Standard mit auf die Platte pipettiert. Anschließend wurde
der Zellüberstand durch mehrmaliges Waschen entfernt und je 50µl Detektion-AK (1:250 in 1x
Assay-Diluent) aufgebracht. Nach einer einstündigen Inkubation wurden je 50µl des Avidin-
HRP-AK in gleicher Verdünnung in die Platte gegeben und eine halbe Stunde bei RT
inkubiert. Abschließend wurde die Platte siebenmal mit Waschpuffer gewaschen und die
Färbereaktion mit je 100µl 1x TMB Substrat-Lösung gestartet. Wenn das Signal stark genug
erschien bzw. nach maximal 15min wurde die Reaktion mit je 50µl Stopp-Lösung (2N H2SO4)
abgestoppt. Die Färbung wurde umgehend nach Abstoppen bei 450nm im ELISA-reader
gemessen.
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