Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
Zum Auftauen der Zellen wurden diese im 37°C Wasserbad möglichst schnell aufgetaut und in
ein mit Medium gefülltes Falconröhrchen überführt, um das DMSO zu verdünnen. Nach
10minütiger Zentrifugation wurden die Zellen in Medium aufgenommen und wie oben
beschrieben kultiviert.
4.5 Transfektion von Zellen
4.5.1 Transfektion von Zellen durch Elektroporation
Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Fremd-DNA in Zellen.
Die meisten Transfektionen wurden mittels Elektroporation mit Hilfe des Gene-Pulsers von
BioRad durchgeführt. Hierbei wird die Zellmembran durch kurze elektrische Impulse für DNA
permeabel gemacht und das gewünschte Plasmid kann so in die Zelle aufgenommen werden.
Transfektion der Maus-T-Zell- Hybridome 58α - β - :
Pro Transfektionsansatz wurden 7x10 6 Zellen eingesetzt. Es musste darauf geachtet werden,
dass die Zellen vor der Transfektion nicht länger als 7-10 Tage in Kultur waren, da sich sonst
die Transfektionseffizienz verminderte. Die Zellen wurden zweimal mit RPMI1640 ohne
Zusätze gewaschen, anschließend in 800µl RPMI1640 ohne Zusätze aufgenommen und nach
Überführen in eine Elektroporationsküvette (0,4cm; BioRad) 10min auf Eis inkubiert. Parallel
dazu wurden 20-30µg präzipitierter Plasmid-DNA 30min bei 14.000rpm zentrifugiert, das
DNA-Sediment unter der Sterilbank getrocknet und in 50µl RPMI1640 ohne Zusätze
aufgenommen. Anschließend wurde die DNA zu den Zellen gegeben und weitere 10min auf
Eis inkubiert. Die Elektroporation wurde bei 960µF und 280V durchgeführt. Nach der
Elektroporation wurden die Zellen erneut 10min auf Eis inkubiert, anschließend in 10ml
vorgewärmtes RPMI1640 mit Zusätzen überführt und 30min bei Raumtemperatur inkubiert.
Zuletzt wurden die Zellen in 25ml-Zellkulturflaschen mit 20ml vorgewärmtem RPMI1640 mit
Zusätzen überführt und zwei Tage inkubiert. Wenn sich das Medium gelb färbte, wurde ein
Teil durch frisches Medium ersetzt.
Nach zwei Tagen wurden die Zellen dann auf 24-well-Platten verteilt und mit den
entsprechenden Selektionsantibiotikum versehen. Nach einer Inkubation von 10-14 Tagen
konnten Klone gepickt und durch FACS-Analyse bzw. IL-2-ELISA analysiert werden.
Transfektion der LTK-Zellen bzw. der TE671-Zellen:
Die Transfektion der adhärent wachsenden LTK- bzw. TE671-Zellen erfolgte nach dem
gleichen Protokoll wie die Maus-T-Zell-Hybridome.
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