Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

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II. Material und Methoden betrug etwa 750.000 Zellen/ml. Je 100µl Zellsuspension wurden anschließend in spezielle Gefäße ähnlich einem PCR-Reaktionsgefäß pipettiert und in einen speziellen Zentrifugeneinsatz gesteckt. Die Gefäße wiesen unten eine kleine Öffnung auf durch die die Zellen beim nachfolgenden Zentrifugieren (8min bei 500rpm) nach und nach auf den Objektträger abgegeben werden konnten. Das Isolieren der Zellen erfolgte dann mittels der unter II.3.4 beschriebenen Methode der Lasermikrodissektion. 3.3 Immunhistologie 3.3.1 Alkalische Phosphatase Färbung (AP-Färbung) Um expandierte T-Zellen in den Biopsieschnitten der untersuchten Patienten spezifisch anzufärben und sie anschließend durch Lasermikrodissektion zu isolieren, wurden immuncytochemische Färbungen durchgeführt. Die auf Folienobjektträger aufgebrachten Gewebeschnitte wurden für 10min bei RT getrocknet und anschließend für 1min in -20°C kaltem Aceton fixiert. Nach dreimaligem Waschen in 1xTBS wurden unspezifische Bindungsstellen durch Inkubation mit 2% Ziegenserum in TBS für 15min blockiert. Anschließend wurde das Gewebe mit dem jeweiligen Primärantikörper gegen die Vβ-Region 40min inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde der Erstantikörper mittels LSAB2-System alkaline phosphatase Kit von DAKO detektiert. Hierzu wurde das Gewebe mit einem gegen den Primärantikörper gerichteten biotinylierten AK für 15min inkubiert und anschließend überschüssiges Material durch Waschen entfernt. Durch Bindung eines Streptavidin-alkalische Phosphatase Konjugats und anschließender Inkubation mit einem Färbesubstrat wurde durch eine enzymatische Reaktion ein unlöslicher Farbstoff erzeugt. So gefärbte positive Zellen konnten unterm Mikroskop detektiert werden. Dem Färbesubstrat wurde zusätzlich Levamisol beigefügt, um eventuell vorhandene endogene Phosphatasen zu inhibieren. Die Färbereaktion wurde unter dem Mikroskop verfolgt und bei ausreichender Färbung mit TBS abgestoppt. Die Präparate wurden anschließend mit 100% Ethanol gespült und konnten nun zur Lasermikrodissektion eingesetzt werden. Um die enthaltene RNA während des Färbevorgangs vor RNAsen zu schützen, wurden alle Absättigungs- bzw. AK-Lösungen mit 3% Prime RNAse Inhibitor (Eppendorf) versetzt. 3.3.2 Immunfluoreszenz-Färbung Färbeprotokoll zur Untersuchung der Quantität und Verteilung der Zellen im Gewebe Eine andere Methode Zellen spezifisch anzufärben ist die Immunfluoreszenzfärbung. Zu Beginn der Arbeit war es nicht möglich, fluoreszenzgefärbte Zellen durch 44
II. Material und Methoden Lasermikrodissektion aus Gewebe zu isolieren. Deshalb wurde diese Methode zunächst dazu verwendet, sich einen Überblick über die Menge und Verteilung der T-Zellen im Gewebe zu verschaffen. Außerdem konnten durch die Fluoreszenzfärbung zwei Oberflächenmoleküle derselben T-Zelle gleichzeitig angefärbt werden, was mit der AP-Färbung nicht möglich war. Die Gewebeschnitte wurden wie in II.3.1 beschrieben auf Objektträger ohne Folie aufgebracht und nach 20 minütiger Fixierung mit 4% Paraformaldehyd gründlich in PBS gewaschen. Nach Absättigung der unspezifischen Bindungsstellen für 20min mit 2% Ziegenserum/2% BSA in PBS wurden die Schnitte 40min mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde der fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper für 30min auf das Gewebe aufgebracht. Bei einer Doppelfärbung wurde der direkt markierte AK erst im zweiten Färbeschritt gemeinsam mit dem sekundären AK eingesetzt. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde der Schnitt mit einem speziellen Eindeckmedium von DAKO eingebettet und unter dem Mikroskop ausgewertet. Färbeprotokoll zur Isolation von T-Zellen aus Gewebe Nachdem ein neues Lasermikrodissektionsgerätes gekauft wurde, war es möglich, auch fluoreszenzgefärbte Zellen aus Geweben zu isolieren. Hierzu musste das Färbeprotokoll geringfügig geändert werden. Die Schnitte wurden auf Folienobjektträger aufgebracht und ohne Fixierung direkt in die Färbung eingesetzt. Nach Absättigung mit 2% Ziegenserum/2% BSA in PBS wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper inkubiert. Nach Waschen des Gewebes mit PBS wurde ein sekundärer AK und bei Bedarf ein direkt markierter AK auf den Schnitt aufgebracht. Nach erneutem Waschen wurden die Muskelgewebeschnitte mit Ethanol abgespült, getrocknet und zum Schneiden verwendet. Das Hirngewebe hingegen wurde mit PBS beschichtet und im feuchten Zustand nach positiven Zellen durchsucht. Nach Trocknen des Gewebes erfolgte auch hier die Isolation der Zellen. Der Grund für die Suche nach Zellen im feuchten Präparat ist die enorme Eigenfluoreszenz des trockenen Hirngewebes. Zur Bewahrung der RNA wurden, wie auch in der AP-Färbung, alle Inkubationslösungen mit 3% Prime RNAse Inhibitor (Eppendorf) versetzt. Kurzfärbeprotokoll Um die RNA noch effektiver zu erhalten, wurde durch die Kollegin Jana Ivanidze ein Kurzprotokoll etabliert, welches im Rahmen dieser Arbeit zur Färbung der Hirnbiopsie angewandt wurde. Hierzu wurden die Gewebsschnitte nach kurzer Beschichtung mit PBS 3min mit 2% BSA in PBS inkubiert. Nach der Absättigung wurden die Schnitte 5min mit dem AK, verdünnt in 2% BSA in PBS, inkubiert und anschließend dreimal mit PBS gespült. Im Falle eines sekundären AK erfolgte eine erneute 3minütige Inkubation. Nach dem Abspülen wurde das Gewebe mit 1-Propanol überschichtet und unter dem Mikroskop nach positiven Zellen 45
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IV. Diskussion durch das entspreche
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IV. Diskussion Hemmer et al. (1999)
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V. Literaturverzeichnis V. Literatu
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