Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
2.5 Gesamt-RNA-Isolierung und cDNA-Herstellung aus eukaryoti-
schen Zellen
2.5.1 Isolierung von Gesamt-RNA aus eukaryotischen Zellen
Zur Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen wurden 0,3 bis 2x10 6 Zellen nach einmaligem
Waschen mit PBS durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand möglichst vollständig
abgenommen. Bis zur Weiterverarbeitung wurden die Zellen bei -80°C eingefroren. Zuerst
wurden die Zellen in 500µl Trizol-Reagenz von Invitrogen, das zuvor auf Raumtemperatur
gebracht wurde, resuspendiert. Nach einer Inkubation von 5min bei RT wurden 100µl
Chloroform hinzugefügt, durch kräftiges Schütteln gemischt und nach weiteren 2-3min
Inkubation für 15min bei 11.000rpm bei 4°C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation war eine
Trennung der Phasen deutlich zu erkennen. Die obere, wässrige Phase, die die RNA enthielt,
wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Um die
RNA besser sichtbar zu machen, wurde je 1µl Glycogen hinzugefügt. Zum Präzipitieren der
RNA wurden 250µl 2-Propanol (Isopropanol) zugegeben und nach kräftigem Schütteln für
10min bei RT inkubiert. Nach einer Zentrifugation von 10min bei 11.000rpm bei 4°C wurde
der Überstand vollständig abgenommen. Zum Waschen der RNA wurden 500µl 75% Ethanol
hinzugefügt, nach kurzem Vortexen für 5min bei 7.000rpm bei 4°C zentrifugiert und der
Überstand vollständig abgenommen. Nach Trocknen der RNA für 5-10min wurde diese in
10µl DEPC-H2O resuspendiert und anschließend durch 10minütiges Erhitzen auf 55-60°C
vollständig gelöst. Die RNA wurde entweder bei -80°C gelagert oder sofort in cDNA
umgeschrieben.
Bei einer Zellmenge von über 2x10 6 wurde die Menge an eingesetztem Trizol, Chloroform,
Isopropanol und Ethanol jeweils verdoppelt.
2.5.2 Erststrang cDNA-Synthese durch reverseTranskription von mRNA
Zum Umschreiben der isolierten mRNA in cDNA wurde das SuperScript TM III Reverse
Transkriptase-Kit von Invitrogen verwendet. Hierzu wurden ca. 1µg RNA mit 1µl Oligo
(dT)12-18 (20ng/µl) gemischt und mit DEPC-H2O auf 12µl aufgefüllt. Nach einer Inkubation
von 10min bei 65°C wurden 1µl 10mM dNTP-Mix, 2µl 0,1M DTT sowie 4µl 5xFirst Strand
Buffer hinzugefügt und 2min bei 45°C inkubiert. Nach Zugabe von 1µl Superscript III
RNaseH - Reverse Transkriptase wurden die Proben weitere 60min bei 45°C inkubiert.
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