Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
Sal I Bgl II Bam HI
Vβ NDN Jβ Cβ
Abb. 31: Schematische Darstellung des Subklonierungsvektors pBRdel
Über die Sal I- und Bgl II-Schnittstellen konnten die rekombinierten V-NDN-J-DNA-Sequenzen der
β-Ketten ausgetauscht und dabei in pBRdel mit der Sequenz des konstanten Bereichs zu vollständig
kodierenden TZR-Ketten verbunden werden.
Anschließend transformierten wir den Vektor mit dem Vβ1-TZR-Fragment mittels
Elektroporation (II.2.2.2) in DH5α-Bakterienzellen, isolierten am folgenden Tag Kolonien von
der Agarplatte und detektierten positive Klone mittels PCR-Screening. Zwei Klone wurden
ausgewählt und nochmals durch Sequenzierung überprüft.
Nun konnte die komplette TZR-β-Kette aus dem Zwischenvektor pBRdel mittels SalI-BamHI-
Restriktionsverdau herausgeschnitten und in den ebenfalls SalI-BamHI geschnittenen
Zielvektor pRSV5neo hineinkloniert werden (Abb. 32).
Sal I Bgl II Bam HI
Vβ NDN Jβ Cβ
Abb. 32: Schematische Darstellung des Expressionsvektors pRSV5neo
Aus dem Subklonierungsvektor pBRdel wurden die vollständigen TZR-DNA-Sequenzen über die
Schnittstellen Sal I und Bam HI herausgeschnitten und in den Expressionsvektor pRSV5neo umkloniert.
Wir analysierten die erhaltenen Klone durch PCR-Screening und überprüften jeweils zwei
ausgewählte Klone durch Sequenzierung.
Nach Bestätigung der Sequenz bereiteten wir die Kette für die Transfektion in die Maus-
Hybridomzelllinie vor.
77