Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
4.2.2 Klonierung der TZR-α-Ketten in den Vektor pRSV5hygro
Die Klonierung der vier TZR-α-Ketten Vα2.2-Jα54 (Zelle 435), Vα11-Jα31 (Zelle 225),
Vα20 -Jα37 (Zelle 458) sowie Vα23-Jα40 (Zelle 1506) erfolgte nach dem gleichen Prinzip
wie die Klonierung der TZR-Kette Vβ1-Jβ1.2, jedoch ohne Zwischenklonierung in den Vektor
pBRdel. Die α-Ketten wurden sofort nach Amplifikation und Ligation in den
Expressionsvektor pRSV5hygro kloniert, der wiederum bereits den konstanten Teil der TZR-
α-Kette enthielt. Die Primer für die Rekonstruktion sind im Material und Methodenteil unter
II.1.6.2.1 aufgeführt.
Als Beispiel ist hier
die Klonierung der TZR-α-Kette Vα2.2-Jα54 aufgeführt. Durch eine
günstige Platzierung
der Oligonukleotide war es möglich, die TZR-Kette aus zwei und nicht
aus drei Fragmenten zusammenzusetzen.
Nach Amplifikation beider Fragmente mit den Primern C_AV2_SalI lead gegen
C_AV2_BsrDI rev sowie C_AV2_BsrDI for
gegen C_AV2_PvuII rev, verdauten wir diese mit
dem Restriktionsenzymen BsrDI und ligierten sie miteinander. Nach Amplifikation des
Ligationsproduktes und Restriktion mit SalI und PvuII klonierten wir das Fragment in den
ebenfalls SalI-PvuII verdauten Expressionsvektor pRSV5hygro.
Die Ligation wurde in die Bakterienzellen DH5α transformiert, die erhaltenen Kolonien durch
PCR-Screening analysiert und ein korrekter Klon zur Transformation vorbereitet.
. Expression der TZR-αβ-Ketten im Maus-Hybridom 58α - β -
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Nach der Rekonstruktion der β- sowie der vier α-Ketten des Patienten PM16488 konnten die
Vβ1-Jβ1.2-Kette mit jeweils einer der vier α-Ketten in die Maus-Hybridomzelllinie 58α - β -
mittels Elektroporation cotransfiziert werden. Der Vorteil dieser Hybridomzelllinie ist, dass sie
selbst keinen eigenen TZR, jedoch den murinen CD3-Komplex sowie alle nötigen Moleküle
zur Signalübertragung exprimiert. Lediglich den CD8-Corezeptor mussten wir, wie in II.4.6
beschrieben, zusätzlich in die Zelle transfizieren.
5.1
Cotransfektion der αβ-Ketten
Vor der Transfektion wurde die TZR-β-Kette
durch NdeI, die TZR-α-Ketten durch XmnI
linearisiert und durch Ethanol/NaAcetat gefällt. Dies ist für die β-Kette sowie die Vα2.2-Jα54
in Abb. 33. dargestellt. Die Linearisierung der Ketten erleichtert den Einbau der TZR-Sequenz
in das Genom der Zelle und somit eine stabile Expression des TZR.
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