Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

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I. Einleitung Abb. 6 zeigt die einzelnen Schritte nochmals in einer Graphik zusammengefasst. Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 4 Schritt 5 Schritt 6 Schritt 7 Schritt 8 Identifizierung klonal expandierter TZR β-Ketten durch CDR3-Spektratyping Färbung von Biopsien auf korrespondierende TZR Vβ-Regionen und Isolation der Einzelzellen durch Lasermikrodissektion RT-Reaktion und α- und β-Ketten Prä-Amplifikation β-Ketten PCR (mit klonspezifischen Primern) α-Ketten PCR (mit universellen Primer Sets) Identifikation gepaarter αβ-TZR-Ketten α-Ketten PCR (mit klonspezifischen Primern) Bestätigung und Identifizierung zusätzlicher αβ-Paare Expression funktioneller αβ-TZR-Moleküle in murinen T-Hybridomzellen Antigensuche nur β-positive Zellen alle β-positiven Zellen Abb. 6: Vorgehensweise zur Isolation und Identifizierung von αβ-TZR-Pärchen aus Gewebe Dass Schema zeigt die einzelnen Schritte, die notwendig sind, um aus einer Gewebsbiopsie potentiell autoaggressive T-Lymphozyten detektieren, isolieren und analysieren zu können. Nach der Detektion expandierter TZR-β-Ketten (Schritt 1) erfolgt die Färbung und Isolation der Zellen (Schritt 2). Die Analyse der Einzelzellen konzentriert sich nach der cDNA-Synthese und der Prä-Amplifikation (Schritt 3) zunächst auf die β-Kette (Schritt 4).Die β-positiven Zellen werden dann auf eine gepaarte α-Kette untersucht und bestätigt (Schritt 5 und 6). Die αβ-Paare werden dann in eine Hybridomzelllinie transfiziert und zur Antigensuche verwendet. (verändert nach Seitz et al., 2006) 16
II. Material und Methoden II. Material und Methoden 1. Material 1.1 Geräte Autoklav Varioklav EP-Z500, EV-Z500 H+P Labortechnik Brutschrank BBD 6220 Heraeus Videokameras: CCD Videokamera Sony HVD30 Hitachi Axiocam HRc Zeiss Computerprogramme: MicroDissection Molecular Machines Palm Robo@V3.0 PALM Microlaser Genescan 3.2.1 Applied Biosystems Sequencing Analysis 3.4.1 Applied Biosystems Elektrophoresekammern/Netzgeräte Amersham-Pharmacia, institutseigene Werkstatt Elektroporationsgerät Gene Pulser TM Bio-Rad ELISA-Reader MR 4000 Dynatech Eismaschine Ziegra FACS: FACScan, FACSCalibur Becton-Dickinson FACS Sorter Facs Vantage SE Becton-Dickinson Geldokumentationsanlage Image Master VDS Pharmacia Biotech Heizblöcke Thermomixer 5436 Eppendorf Kryotom CM3050 Leica Kühlinkubator Frigomix U2 (Braun) Gefrierschrank C660 New Brubswick Scientific Laser SL Mikrotest Leuchtschirm Bachofer Laborgeräte Lyophilisator LYOVAC GT 2 Leybold Magnetrührer IKAMAG RCT IKA Labortechnik Mikroskope: Axiovert 25 Zeiss Axiovert 200M Zeiss Axioplan2 Zeiss Mikrowellenofen Alaska Öl-Vakuumpumpe ABM PCR-Thermocyler: T personal Biometra GeneAmp PCR system 9600 Perkin Elmer 17
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Seite 3 und 4: Eingereicht am: 13.02.2007 Mitglied
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Seite 7 und 8: Inhaltsverzeichnis 4.8.2 Spezifisch
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Seite 13 und 14: I. Einleitung Die Grundstruktur der
Seite 15 und 16: I. Einleitung Der CD3-Komplex ist f
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Seite 25: I. Einleitung Um die expandierten
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Seite 35 und 36: II. Material und Methoden 1.8 Eukar
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Seite 53 und 54: II. Material und Methoden 1. PCR 2.
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Seite 67 und 68: III. Ergebnisse V-Region J-Region r
Seite 69 und 70: III. Ergebnisse 2.1 Färbung und Is
Seite 71 und 72: III. Ergebnisse Die CD8-Übersichts
Seite 73 und 74: III. Ergebnisse positives Signal ze
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III. Ergebnisse (II.3.2) auf Folien
Seite 79 und 80:
III. Ergebnisse Abb. 22a: Analyse d
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III. Ergebnisse Abb. 24: PCR-Produk
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III. Ergebnisse rev-spec; Vα-11-fo
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III. Ergebnisse Abb. 30: PCR-Produk
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III. Ergebnisse Sal I Bgl II Bam HI
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III. Ergebnisse Abb. 33: Überprüf
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III. Ergebnisse 5.2.3 CD8-Transdukt
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III. Ergebnisse Abb. 37a: FACS-Anal
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III. Ergebnisse 7.1.1 Expression de
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III. Ergebnisse transfiziert und ü
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III. Ergebnisse 8. Versuch der Iden
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III. Ergebnisse Abb. 44: Position 3
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IV. Diskussion IV. Diskussion Der H
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IV. Diskussion Vβ1 sowie Vβ23, is
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IV. Diskussion aus diagnostischen G
Seite 109 und 110:
IV. Diskussion durch das entspreche
Seite 111 und 112:
IV. Diskussion Hemmer et al. (1999)
Seite 113 und 114:
V. Literaturverzeichnis V. Literatu
Seite 115 und 116:
V. Literaturverzeichnis Engel, A.G.
Seite 117 und 118:
V. Literaturverzeichnis Kinne, R.W.
Seite 119 und 120:
V. Literaturverzeichnis Steinman, L
Seite 121 und 122:
VI. Anhang VI. Anhang 1. Sequenzen
Seite 123 und 124:
Erklärung gemäß §4 Abs. 3 S. 3,
Seite 125 und 126:
Vorname: Sabine Nachname: Seitz Leb
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