Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
(II.3.2) auf Folienobjektträger aufgebracht, einzelne Zellen durch Lasermikrodissektion isoliert
und analysiert.
3.1.1 Effizienz für die Amplifikation eines TZR ungefärbter sowie gefärbter
Zellen
Im ersten Vorversuch testeten wir die Effizienz der PCR ungefärbter Zellen sowie fluoreszenzbzw.
AP-gefärbter Zellen. Die nicht gefärbten Zellen gaben Aufschluss über die generelle
PCR-Effizienz, die gefärbten Zellen über die Auswirkung einer Färbung auf die Qualität und
Stabilität der RNA. Alle isolierten Zellen wurden anschließend mit der Einzelzell-RT-PCR
analysiert, wobei für die TZR-β-Kette klonspezifische Primer für Vβ17 (Vβ-17-for-out - COP-
1/17β-rev-out sowie Vβ-17-for-in - COP-1/17β-rev-in) und für die TZR-α-Kette universelle
Primer Sets eingesetzt wurden (Vα-X1-24 -for-out - Cα-rev-out sowie Vα-Set a-e - Cα-rev-in).
Wir überprüften nur diejenigen Zellen auf eine α-Kette, die ein positives Ergebnis in der β-
Ketten-PCR lieferten. Die genauen Sequenzen der verwendeten Primer sind im Material und
Methodenteil aufgeführt (II.1.6.1).
Die nachfolgende Tabelle zeigt die Effizienz der Einzelzell-RT-PCR ungefärbter,
fluoreszenzgefärbter oder mit alkalischer Phosphatase gefärbter Zellen.
Anzahl analysierter
Zellen
Vβ17-Kette
Vβ17- und
Vα2.3-Kette
ungefärbt 89 49 (55%) 48 (54%)
fluoreszenzgefärbt 90 20 (22%) 15 (16,7%)
AP gefärbt 90 14 (15,5%) 6 (6,7%)
Tabelle 3: Analyse ungefärbter sowie gefärbter COP-1-Einzelzellen durch Einzelzell-RT-PCR
Nach Isolation der COP-1-Einzelzellen wurden diese durch Einzelzell-RT-PCR analysiert. Die Analyse
ergab für die ungefärbten Zellen eine wesentlich höhere Effizienz (54%) als für die gefärbten Zellen
(fluoreszenzgefärbt: 16,7%, AP-gefärbt: 6,7%).
Das Ergebnis zeigt, dass wir bei 55% der ungefärbten Zellen ein PCR-Produkt detektieren
konnten. Fast alle Zellen, die eine β-Kette zeigten waren auch positiv für die α-Kette. Eine
Färbung der Zellen setzt die Effizienz der PCR-Methode deutlich herab, wobei die Färbung
mit fluoreszenzmarkierten AK (16,7%) ein besseres Ergebnis zeigt als die Färbung mit
alkalischer Phosphatase (6,7%).
Abb. 20 zeigt einen Teil der TZR-β-Ketten-Analyse isolierter COP-1-Einzelzellen. Die
Amplifikation der TZR-Vβ17-Kette mit klonspezifischen Primern lieferte das erwartete
Produkt von 150bp.
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