Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
4.6 Transduktion von Zellen mit Hilfe von Retroviren
Unter einer Transduktion versteht man die Übertragung von Genen mit Hilfe von Viren. Hier
wurde das Gen für den menschlichen CD8-Corezeptor mittels Retroviren in die Maus-
Hybridomzellen eingebracht.
Als Zelllinie für die Retrovirus-Produktion wurde die Verpackungszelllinie GP+E 86 (Klon
1A1) verwendet, welche zuvor mit einem retroviralen Vektor, der das Gen für den
menschlichen CD8-Corezeptor trug, transfiziert wurde. Die Virionen, die nun von der
Verpackungszelllinie produziert wurden, konnten die Zielzellen infizieren und das übertragene
Gen wurde exprimiert.
Am Vortag wurden die GP+Es 86 in eine 6-well-Platte ausgebracht, so dass sie am nächsten
Tag eine Konfluenz von etwa 40% aufwiesen. Anschließend wurden 5x10 4 Zellen der zu
transduzierenden Maus-Hybridomzellen pro ml Medium zugegeben und für 48 Stunden cokultiviert.
Während dieser Zeit wurde kein Selektionsantibiotikum ins Medium gegeben. Nach
zwei Tagen wurden die Hybridomzellen vorsichtig abgenommen und nun unter
Selektionsdruck weiter kultiviert. Der Erfolg der Transduktion konnte nach 4-5 Tagen mittels
FACS-Analyse überprüft werden.
4.7 FACS-Analyse
Zum Nachweis von Oberflächenproteinen wurden die Zellen durchflußzytometrisch mit
einem FACS-Gerät (FACSSort, FACSCalibur von Becton Dickinson) analysiert.
Für jede Färbung wurden mind. 50.000-200.000 Zellen benötigt. Die Zellen wurden in die
entsprechenden Näpfe einer 96-well-Spitzbodenplatte überführt und zweimal mit 200µl FACS-
Puffer (1% FCS in PBS) gewaschen. Es wurden sowohl Färbungen mit direkt markierten AK,
als auch Färbungen bei denen der sekundäre AK markiert war, durchgeführt. Die Zellen
wurden in 50µl verdünnter AK-Lösung 30min auf Eis im Dunkeln inkubiert (Verdünnung 1:50
in FACS-Puffer) und anschließend erneut zweimal mit 200µl FACS-Puffer gewaschen. Wurde
ein sekundärer AK zur Färbung eingesetzt, wurde das Verfahren mit einer Verdünnung von
1:200 wiederholt. Nach der letzten AK-Färbung wurden die Zellen zur Messung in FACS-
Röhrchen überführt. Um die Detektion toter Zellen zu ermöglichen, wurde Propidiumjodid in
einer Konzentration von 2µg/ml zu den gefärbten Zellen gegeben. Tote Zellen nehmen
aufgrund ihrer defekten Zellmembran Propidiumjodid auf und zeigen daher bei einer
Wellenlänge von 600-650nm ein starkes Signal. So konnte diese tote Zellpopulation bei der
Analyse der Zellen ausgeschlossen werden.
Mit dem FACS-Gerät wurden die Parameter Licht-Streuung, Extinktion und Fluoreszenz der
einzelnen Zellen bei den jeweils erforderlichen Wellenlängen gemessen. Der
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