Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

II. Material und Methoden
2.6.2 DNA-Größenstandards
Zur Größenbestimmung der DNA-Fragmente wurden parallel zu den DNA-Proben DNA-
Größenstandards aufgetragen.
A B
Abb. 7: DNA-Größenstandards von
New England Biolabs
A: 100bp-Marker
B: 1kbp-Marker
2.6.3 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Zur Isolierung von DNA-Fragmenten aus einem Agarosegel wurde das Easy Pure DNA-
Purification Kit von Biozym verwendet. Hierzu wurde das gewünschte DNA-Fragment mit
einem Skalpell unter UV-Licht aus dem Gel herausgeschnitten, in ein 1,5ml Eppendorf-
Reaktionsgefäß überführt und gewogen. Ein mg Agarosegel entsprach einem Volumen von
1µl. Zum Gelstück wurden nun 0,5 Volumen MELT sowie 2,5 Volumen SALT hinzugefügt,
durch Vortexen gemischt und bei 55°C solange inkubiert bis sich das Gelstück vollständig
gelöst hatte. Anschließend wurde entsprechend der zu erwartenden Menge an DNA 5-10µl
BIND (+1µl/µg zu erwartender DNA-Menge) zugegeben und durch kurzes Schütteln gut
gemischt. Nach einer 5minütigen Inkubation bei RT wurde das Gemisch für 15sec bei
14.000rpm zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde anschließend mit
1ml Waschpuffer gewaschen und nach erneuter 5minütiger Inkubation kurz zentrifugiert. Das
Sediment wurde 5-10min bei 40°C getrocknet und dann je nach DNA-Menge in 10-50µl EB-
Puffer gelöst.
2.6.4 Reinigung von DNA-Fragmenten
Zur schnellen Abtrennung von Enzymen, Nukleotiden und Primern von DNA-Fragmenten
oder zur Umpufferung wurde der QIAquick PCR-Purification-Kit (Qiagen) eingesetzt. Die
DNA-Probe wurde zunächst mit dem 5-fachen Volumen PB Puffer gemischt, auf die
QuickSpin Säule gegeben, die ein maximales Fasungsvermögen von 10µg DNA besaß, und
1min bei 13.000rpm zentrifugiert. Nach Waschen mit 750µl PE Puffer und erneuter
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