Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

III. Ergebnisse
6.1 Klonierung der TZR-αβ-Kette und Expression im Maus-
Hybridom 58α - β -
Die Klonierung der α- und β-Kette des TZR JM22 erfolgte mit den im Material- und
Methodenteil unter II.1.6.2.2 aufgeführten Oligonukleotiden (JM22 Vbeta for; JM22 VJbeta
rev; JM22 AV10 lead; JM22 VJalpha rev; JM22 Jalpha for).
Die TZR-β-Kette Vβ17-Jβ2.7 konnte mittels geschickter Auswahl an Oligonukleotiden aus
zwei bereits vorhandenen TZR-Konstrukten zusammengefügt werden. Die TZR-α-Kette
Vα10-Jα42 wurde komplett aus Lymphozyten-cDNA eines unbeteiligten Spenders
amplifiziert.
Nach Elektroporation in DH5α-Bakterienzellen konnten wir positive Klone mittels PCR-
Screening detektieren und durch Sequenzierung überprüfen.
Anschließend transfizierten wir die beiden linearisierten und gefällten TZR-Ketten wie die
TZR-Ketten des Patienten PM16488 durch Elektroporation in die Hybridomzelllinie 58α - β - .
Die nach zwei bis drei Wochen auftretenden einzelnen Antibiotika-resistenten Zellklone
wurden isoliert und charakterisiert.
Wie in III.5.2 bereits beschrieben charakterisierten wir die erhaltenen Zellklone durch FACS-
Analyse sowie Aktivierung mittels AK. Für die FACS-Analyse verwendeten wir den AK
gegen die murine CD3ε-Kette sowie den AK gegen die menschliche Vβ17-Region. Als
Negativkontrolle diente eine Färbung mit dem AK gegen die Vβ1-Region, welche nicht auf der
Zelloberfläche exprimiert wird. Die Aktivierung der Transfektante erfolgte durch den anti-
CD3ε-AK. Als Negativkontrolle wurde die Isotypkontrolle Hamster IgG eingesetzt.
Die FACS-Analyse in Abb. 37a zeigten einen deutlichen Schift sowohl bei der CD3ε- als auch
der Vβ17-Färbung gegenüber der Isotypkontrolle. Dies beweist eindeutig die Expression der
TZR-Moleküle auf der Zelloberfläche.
Auch die IL-2-Abgabe der Maus-Hybridome nach der AK-Aktivierung gemessen durch einen
IL-2-ELISA zeigt eine ausreichende Funktionalität der Transfektante Abb. 37b.
Wie unter Punkt III.5.2.3 bereits beschrieben, wurde auch die JM22-Transfektante durch
retrovirale Transduktion mit dem humanen CD8-Corezeptor transduziert und der Erfolg mittels
FACS-Analyse mit dem AK gegen die β-Kette des CD8-Moleküls überprüft (Ergebnis hier
nicht gezeigt).
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