Identifikation und Charakterisierung - OPUS - Universität Würzburg

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III. Ergebnisse 6.1 Klonierung der TZR-αβ-Kette und Expression im Maus- Hybridom 58α - β - Die Klonierung der α- und β-Kette des TZR JM22 erfolgte mit den im Material- und Methodenteil unter II.1.6.2.2 aufgeführten Oligonukleotiden (JM22 Vbeta for; JM22 VJbeta rev; JM22 AV10 lead; JM22 VJalpha rev; JM22 Jalpha for). Die TZR-β-Kette Vβ17-Jβ2.7 konnte mittels geschickter Auswahl an Oligonukleotiden aus zwei bereits vorhandenen TZR-Konstrukten zusammengefügt werden. Die TZR-α-Kette Vα10-Jα42 wurde komplett aus Lymphozyten-cDNA eines unbeteiligten Spenders amplifiziert. Nach Elektroporation in DH5α-Bakterienzellen konnten wir positive Klone mittels PCR- Screening detektieren und durch Sequenzierung überprüfen. Anschließend transfizierten wir die beiden linearisierten und gefällten TZR-Ketten wie die TZR-Ketten des Patienten PM16488 durch Elektroporation in die Hybridomzelllinie 58α - β - . Die nach zwei bis drei Wochen auftretenden einzelnen Antibiotika-resistenten Zellklone wurden isoliert und charakterisiert. Wie in III.5.2 bereits beschrieben charakterisierten wir die erhaltenen Zellklone durch FACS- Analyse sowie Aktivierung mittels AK. Für die FACS-Analyse verwendeten wir den AK gegen die murine CD3ε-Kette sowie den AK gegen die menschliche Vβ17-Region. Als Negativkontrolle diente eine Färbung mit dem AK gegen die Vβ1-Region, welche nicht auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Die Aktivierung der Transfektante erfolgte durch den anti- CD3ε-AK. Als Negativkontrolle wurde die Isotypkontrolle Hamster IgG eingesetzt. Die FACS-Analyse in Abb. 37a zeigten einen deutlichen Schift sowohl bei der CD3ε- als auch der Vβ17-Färbung gegenüber der Isotypkontrolle. Dies beweist eindeutig die Expression der TZR-Moleküle auf der Zelloberfläche. Auch die IL-2-Abgabe der Maus-Hybridome nach der AK-Aktivierung gemessen durch einen IL-2-ELISA zeigt eine ausreichende Funktionalität der Transfektante Abb. 37b. Wie unter Punkt III.5.2.3 bereits beschrieben, wurde auch die JM22-Transfektante durch retrovirale Transduktion mit dem humanen CD8-Corezeptor transduziert und der Erfolg mittels FACS-Analyse mit dem AK gegen die β-Kette des CD8-Moleküls überprüft (Ergebnis hier nicht gezeigt). 82
III. Ergebnisse Abb. 37a: FACS-Analyse der JM22-TZR-Transfektante zum Nachweis der CD3- bzw. Vβ17- Expression auf der Zelloberfläche In einer FACS-Analyse wurde die Oberflächenexpression des CD3- sowie des Vβ17-Moleküls der TZR- Transfektante JM22 überprüft, welche ein positives Ergebnis zeigte. Als Negativkontrolle wurde eine Färbung gegen eine nicht exprimierte TZR-β-Kette (Vβ1) durchgeführt. anti-CD3: JM22 nach Färbung mit dem AK gegen murines CD3 anti-Vβ17: JM22 nach Färbung mit dem AK gegen humanes Vβ17 anti-Vβ1: JM22 nach Färbung mit dem AK gegen humanes Vβ1 als Negativkontrolle Abb. 37b: IL-2-ELISA der JM22-TZR-Transfektante nach Aktivierung durch den CD3- Antikörper Durch eine Aktivierung mit dem CD3ε-AK wurde die Fähigkeit der Transfektante, IL-2 zu sekretieren überprüft. Hierfür wurden die Zellen 13-16h in mit AK beschichteten 96-Lochplatten inkubiert und das ins Medium abgegebene IL-2 am nächsten Tag in einem IL-2-ELISA gemessen. Als Negativkontrolle wurde eine Hamster-Isotypkontrolle verwendet. Die Transfektante JM22 zeigte eine deutliche IL-2-Ausschüttung. 6.2 Ermittlung der Empfindlichkeit des TZR JM22 durch Peptidtitration Um herauszufinden, wie stark die JM22-Transfektante, durch das synthetische Peptid flu 58-66 aktiviert werden kann und welche Peptid-Konzentration am geeignetsten ist, führten wir eine Peptidtitration durch. Hierzu wurden HLA-A*02-positive LTK-Zellen ausgebracht und sechs Stunden mit unterschiedlichen flu-Peptid-Konzentrationen inkubiert bevor die JM22- Transfektante zugegeben wurde. Am nächsten Tag erfolgte die Messung der IL-2- Konzentration in den Überständen. Abb. 38: Peptidtitrationskurve der Transfektante JM22 nach Aktivierung durch das synthetische flu- Peptid 58-66 Zur Überprüfung der Aktivierbarkeit der JM22 Transfekante durch das synthetische flu-Peptid 58-66, wurden HLA-A*02 positive LTK-Zellen 6h mit verscheidenen Konzentratinonen an Peptid beladen und anschließend 13-16h mit der JM22 Transfektante inkubiert. Die Menge an ausgeschüttetem IL-2 wurde am folgenden Tag durch einen IL-2-ELISA gemessen. Die x-Achse zeigt die Menge an eingesetztem flu-Peptid, die y-Achse die optische Dichte gemessen bei 450nm. 83
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Eingereicht am: 13.02.2007 Mitglied
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