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Drogue Charge virale Figure 17 : Déroulement du DRESS (hypothèse) (d’après Shiohara et al., 2006) II. Etude de la réplication virale en présence de molécules associées au DRESS Dans l’hypothèse où la réactivation de l’HHV-6 se produit dans un premier temps lors du déroulement du DRESS, et induit ensuite une réponse immunitaire dirigée par les cellules T et entraînant l’apparition des symptômes, l’infection par l’HHV-6 se déclenche donc durant la prise médicamenteuse, bien que les mécanismes de réactivation soient inconnus. Afin d’apporter des éléments de réponse, nous avons étudié le comportement de la réplication virale de la souche HST du variant B de l’HHV-6, en présence de molécules fréquemment associées à des cas cliniques de DRESS (valproate de sodium, carbamazepine, phénytoïne, sulfasalazine ou amoxicilline), le variant B de l’HHV-6 étant très fréquemment détecté dans les DRESS. Temps Le valproate de sodium, la phénytoïne et la carbamazépine sont trés utilisés dans le traitement de l’épilepsie, la sulfasalazine est utilisée dans le traitement anti-inflammatoire de la polyarthrite rhumatoïde, et l’amoxicilline est un antibiotique utilisé dans le traitement des infections bactériennes à germes sensibles. Réponse immunitaire antivirale Symptômes cliniques 76
La réplication virale de virus autres que l’HHV-6 a été montrée comme étant stimulée par certaines de ces molécules. Le valproate de sodium entraîne une augmentation de la réplication de l’HHV-8 (Shaw et al., 2000) et du HCMV (Kuntz-Simon et Obert, 1995). La réplication du VIH a été montrée comme étant stimulée par le valproate de sodium, la carbamazépine et la phénytoïne, via une transactivation du promoteur des séquences LTR (long terminal repeat) (Robinson et al., 2006). La souche HST du variant B de l’HHV-6 est cultivé par co-culture avec la lignée lymphocytaire T MT4. Afin d’étudier la réplication virale de façon précise et reproductible, nous avons procédé à des infections synchrones des cellules MT4. Cette étape consiste en la mise en contact de virions préalablement purifiés avec les cellules par centrifugation, afin d’obtenir de celles-ci qu’elles soient infectées en même temps, ce qui permet d’observer par la suite une synchronisation du cycle de réplication viral entre les différentes cellules infectées. Il a donc été nécessaire de constituer au préalable un stock de particules virales purifiées. Dans cet objectif, de grandes quantités de cultures virales ont été groupées. Puis les cellules ont été éclatées par la succession de deux cycles de congélation/décongélation, et les débris cellulaires ont alors été éliminés par centrifugation. Les surnageants ainsi obtenus ont ensuite été soumis à une ultracentrifugation (1 heure, 100000g), et les virions purifiés se trouvant dans le culot ont été regroupés en un stock global de particules virales. Ce stock a ensuite été titré, afin de déterminer la dose à utiliser pour induire une multiplicité d’infection ou M.O.I. (multiplicity of infection) voulue dans un nombre fixe de cellules. Diverses dilutions de ce stock ont donc été utilisées pour infecter 5x10 5 cellules MT4. L’infection synchrone a été réalisée par centrifugation : 1 heure à 37°C, 2000 rpm (rotations par minutes). Après 24 heures d’incubation, le pourcentage de cellules infectées a alors été déterminé par immunomarquage, en utilisant un anticorps dirigé contre une protéine précoce de l’HHV-6, la protéine p41 (facteur de processivité de l’ADN polymérase virale), puis un anticorps secondaire couplé à la fluorescéine ou FITC (fluorescein isothiocyanate). Le pourcentage de cellules infectées a ensuite été déterminé par comptage au microscope à fluorescence. Elles sont aisément reconnaissables par leur aspect ballonisé (formation de syncytia) et leur couleur verte due au marquage fluorescent (figure 18). Pour chaque essai, deux opérateurs indépendants ont compté trois champs de cellules marquées, et la moyenne des résultats obtenus a été calculée (tableau 8). 77
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Environnement bibliographique Parti
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sont détectés environ 3h après l
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