Rôle de l'herpèsvirus humain de type 6 dans le ... - Epublications

du gène U22 est donc directement représentative du nombre de génomes viraux dans chaque
essai. La quantification se fait grâce à l’utilisation d’une sonde spécifique de la région amplifiée
du gène U22, et marquée par une molécule fluorescente FAM-TAMRA (6-
carboxytétraméthylrhodamine) à l’exptrémité 5’, et par une molécule « quencher » à l’exprémité
3’. Celle-ci inhibe la fluorescence du FAM-TAMRA lorsqu’elle est à sa proximité. Lorsque la
séquence cible est amplifiée, la sonde qui y est hybridée spécifiquement est alors dégradée grâce
à l’activité 5’-3’ exonucléase de la polymérase utilisée, permettant ainsi de « libérer » un signal
fluorescent quantifiable, produit par le marquage FAM-TAMRA.
Afin d’évaluer la cytotoxicité des molécules étudiées sur les cellules MT4, la technique de
coloration par le 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium bromide (MTT) a été
utilisée. Elle est basée sur le clivage du sel de tétrazolium MTT jaune, en cristaux de formazan
violets insolubles en milieu aqueux. Ce clivage s’effectue grâce à diverses enzymes cellulaires
actives, dont les principales sont des déshydrogénases. Cette conversion se produit donc
uniquement dans les cellules vivantes, et la quantité de formazan formée est proportionnelle au
nombre de cellules viables. Les cristaux de formazan formés peuvent alors être solubilisés dans
du DMSO (diméthylsulfoxide) et la solution colorée résultante peut être quantifiée au
spectrophotomètre par mesure de l’absorbance à 540 nm.
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