Rôle de l'herpèsvirus humain de type 6 dans le ... - Epublications

La réplication virale de virus autres que l’HHV-6 a été montrée comme étant stimulée par
certaines de ces molécules. Le valproate de sodium entraîne une augmentation de la réplication
de l’HHV-8 (Shaw et al., 2000) et du HCMV (Kuntz-Simon et Obert, 1995). La réplication du
VIH a été montrée comme étant stimulée par le valproate de sodium, la carbamazépine et la
phénytoïne, via une transactivation du promoteur des séquences LTR (long terminal repeat)
(Robinson et al., 2006).
La souche HST du variant B de l’HHV-6 est cultivé par co-culture avec la lignée
lymphocytaire T MT4. Afin d’étudier la réplication virale de façon précise et reproductible, nous
avons procédé à des infections synchrones des cellules MT4. Cette étape consiste en la mise en
contact de virions préalablement purifiés avec les cellules par centrifugation, afin d’obtenir de
celles-ci qu’elles soient infectées en même temps, ce qui permet d’observer par la suite une
synchronisation du cycle de réplication viral entre les différentes cellules infectées.
Il a donc été nécessaire de constituer au préalable un stock de particules virales purifiées.
Dans cet objectif, de grandes quantités de cultures virales ont été groupées. Puis les cellules ont
été éclatées par la succession de deux cycles de congélation/décongélation, et les débris
cellulaires ont alors été éliminés par centrifugation. Les surnageants ainsi obtenus ont ensuite été
soumis à une ultracentrifugation (1 heure, 100000g), et les virions purifiés se trouvant dans le
culot ont été regroupés en un stock global de particules virales.
Ce stock a ensuite été titré, afin de déterminer la dose à utiliser pour induire une
multiplicité d’infection ou M.O.I. (multiplicity of infection) voulue dans un nombre fixe de
cellules. Diverses dilutions de ce stock ont donc été utilisées pour infecter 5x10 5 cellules MT4.
L’infection synchrone a été réalisée par centrifugation : 1 heure à 37°C, 2000 rpm (rotations par
minutes). Après 24 heures d’incubation, le pourcentage de cellules infectées a alors été déterminé
par immunomarquage, en utilisant un anticorps dirigé contre une protéine précoce de l’HHV-6, la
protéine p41 (facteur de processivité de l’ADN polymérase virale), puis un anticorps secondaire
couplé à la fluorescéine ou FITC (fluorescein isothiocyanate). Le pourcentage de cellules
infectées a ensuite été déterminé par comptage au microscope à fluorescence. Elles sont aisément
reconnaissables par leur aspect ballonisé (formation de syncytia) et leur couleur verte due au
marquage fluorescent (figure 18). Pour chaque essai, deux opérateurs indépendants ont compté
trois champs de cellules marquées, et la moyenne des résultats obtenus a été calculée (tableau 8).
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