NOWINY LEKARSKIE 4 - Nowiny Lekarskie - UMP

379Proteazy cysteinowe oraz ich autogenne inhibitory w chorobach nowotworowychmożna także oznaczać aktywność cysteinowych peptydazoraz ich inhibitorów w materiale tkankowym uzyskanym wbiopsji lub w trakcie zabiegu operacyjnego (np. z nowotworówżołądka [3], węzłów chłonnych). Przygotowuje się wtym celu homogenaty tkankowe, które następnie poddawanesą wirowaniu, a właściwy materiał do badań stanowisupernatant, który również można zamrażać.Opis metody: W metodzie tej działaniu oznaczanychenzymów proteolitycznych poddaje się syntetyczny substrat– BANA (N-benzoyl–DL–arginine–β–naphtylamine =N-benzoyl-DL-naphtylamide hydrochloride). Aktywnośćcysteinowych peptydaz obecnych w badanym materialehydrolizuje 0,05 mM BANA uwalniając produkt reakcji –β-naftyloaminę, którą oznacza się metodą kolorymetryczną.Warunki reakcji prowadzi się w temperaturze 37°C i pH =6,0 w buforze fosforanowym z dodatkiem 0,02 M EDTAi DL-cysteiny oraz 0,1% merkaptoetanol, inkubacja trwaokoło 12 godzin. Jedna jednostka aktywności enzymu(1 mEU) jest definiowana jako ilość enzymu uwalniająca1 nmol produktu (β-naphtyloaminy) na godzinę, w przeliczeniuna 1 mg białka całkowitego, które można oznaczaćmetodą Bradforda [4] lub Lowry’ego [5] – stosując albuminęwołową jako standard) [6, 7].2. Oznaczanie aktywności enzymów proteolitycznychmetodą spektrofluorometryczną (Barretta i Kirschke)Materiał biologiczny: jak wyżej. Metodę spektrofluorometrycznąwykorzystywano także do badania aktywnościkatepsyn B i L w liniach komórek nowotworowych(np. nowotworów płuc [8]). Materiał bezpośrednio poddawanybadaniu stanowiło specjalnie przygotowanemedium z hodowli komórkowych.Opis metody: Tu substratem poddawanym działaniukatepsyn jest Z-Phe-Arg-AMC dla katepsyny L orazZ-Arg-Arg-AMC dla katepsyny B, z których pod wpływemhydrolizy uwalnia się 7-AMC (= 7-amino-4-methyl-coumarin). Warunki reakcji dobiera się podobniejak wyżej – temp. 37°C, pH = 6,0 (bufor fosforanowy,EDTA, DTT), krótszy jest czas inkubacji 20–60 minut,a reakcję hydrolizy kończy się dodając do próbki kwasjodooctowy. W oznaczeniach kontrolnych stosuje się(pochodzi z mikroorganizmów) inhibitor proteaz cysteinowych– E-64 oraz próbę zerową. Fluorescencję uzyskanegoproduktu (7-AMC) mierzy się przy użyciuspektrofluorometru (długość fali wzbudzenia λ = 370nm, emisji λ = 440 nm). Wartości fluorescencji badanejpróbki odejmuje się od fluorescencji oznaczenia kontrolnegozawierającego E-64, a następnie cechuje wg produktureakcji – 7-AMC. Jednostka aktywności enzymu(1 mEU) jest definiowana jako ilość enzymu, którauwalnia 1 nmol (nM) 7-AMC w ciągu minuty, w przeliczeniuna 1 mg białka [9, 10].3. Oznaczanie aktywności pro-katepsyn (prekursorówproteaz cysteinowych)W celu aktywacji prokatepsyn dodaje się do badanychpróbek pepsynę, inkubacja (preinkubacja) trwa 60minut w temp. 37°C, przy pH = 3,0 (bufor octowy).Następnie bada się aktywność enzymów proteolitycznychjak wyżej. W oznaczeniach kontrolnych stosuje siępróbki bez pro-katepsyny, próbki poddawane tylko inkubacji(37°C przez 60 minut bez innych odczynników)oraz próbki inkubowane w 37°C przez 60 minut z dodatkiembuforu octowego (bez pepsyny). Aktywność prokatepsynywylicza się jako różnicę aktywności katepsynypo preinkubacji z pepsyną i aktywności katepsyny„wolnej” (w próbce nie poddawanej działaniu pepsyny)[11, 12, 3].4. Oznaczanie aktywności inhibitorów proteaz tiolowychza pomocą papainy metodą kolorymetrycznąMateriał biologiczny: jak wyżej.Opis metody: W metodzie tej wykorzystuje się papainęjako łatwo dostępne źródło enzymu imitującegoendopeptydazy cysteinowe. Aktywność papainy oznaczasię rutynowo w reakcji z BANA metodą kolorymetryczną(patrz wyżej), następnie bada się tą samą metodąaktywność papainową w próbkach z dodatkiem materiałubiologicznego zawierającego inhibitory proteaz. Jednąjednostkę aktywności inhibitora definiuje się jako ilośćinhibitora, która hamuje jedną jednostkę aktywnościpapainowej. Uzyskana w ten sposób wartość odpowiadaaktywności wolnych inhibitorów proteaz cysteinowych(ICP37 w przeliczeniu na białko całkowite oznaczonemetodą Bradforda). Wiadomo jednak, że część inhibitorówproteaz cysteinowych pozostaje w formie nieaktywnej,związanej w kompleksy enzym-inhibitor. Uwolnieniezwiązanych inhibitorów można uzyskać przez 20-minutową preinkubację próbki w pH = 2,0 (bufor glicynowy)i temp. 80–100°C (niszczy się też wtedy proteazy,a inhibitory uwalniają się). Oznaczona w tak przygotowanymmateriale aktywność inhibitorów proteaz odpowiadaich aktywności całkowitej (ICP80). Ilość inhibitorówzwiązanych w kompleksy jest różnicą pomiędzyICP80 i ICP37 = ∆ICP [13, 14].5. Inaktywacja α2-makroglobulinyα2-makroglobulina (zawarta w materiale biologicznym)jest głównym naturalnym inhibitorem endoproteaz (nietylko cysteinowych) i może interferować z oznaczeniemICP. Minakata [14] opisał metodę inaktywacji α2-makroglobuliny(α2-M) przy użyciu metylaminę (w 55°C przypH 7,5) ICP pozostają w tych warunkach całkowicie stabilne).Znalazła ona rutynowe zastosowanie w oznaczeniachaktywności cystatyn w płynach i homogenatach tkanekzawierających ten inhibitor [11, 16].6. Oznaczanie aktywności cystatyn wobec pepsynymetodą spektrofluorometryczną (wg Heidtmana)W metodzie tej oznacza się całkowitą aktywność inhibitorową,tj. po preinkubacji próbek materiału w wysokiejtemp. (100°C przez 10 minut). Stosuje się tuoczyszczoną papainę, której aktywność określa się poprzezmiareczkowanie z E-64. Próbki inkubuje się zpapainą w temp. 37°C, pH = 5,5 (0,05 % Brij-35 w buforzeoctowym), z dodatkiem EDTA, DTT przez 5–10