Agnieszka Wyrwińska i inni 380minut. Dochodzi wtedy do powstawania kompleksówenzym-inhibitor, a tym samym dezaktywacji enzymu.Pozostała w próbce aktywność papainowa odzwierciedlapośrednio aktywność inhibitorów w badanym materiale.Mierzy się ją dodając substratu dla katepsyny B – Z-Phe-Arg-AMC. Próbki inkubuje się w 37°C przez 30 minut,reakcje proteolizy hamuje się dodając kwas jodooctowy.Wartość fluorescencji określa się przy długości faliwzbudzenia λ = 370 nm i emisji λ = 440 nm wobec próbyzerowej, którą przygotowuje się dodając kwas jodooctowyprzed substratem, a fluorescencję odczytuje woparciu o uwolniony produkt reakcji – 7-AMC. Równocześnieprzygotowuje się oznaczenie kontrolne, w którymmateriał biologiczny zastępuje się mieszaniną buforowąw celu określenia „nie zablokowanej” aktywnościpapainy. Jednostka aktywności inhibitorowej wobecpapainy jest równa jednej jednostce aktywności papainyi odpowiada ilości inhibitora całkowicie hamującegoaktywność papainy. Liczbę tę ustala się przez ekstrapolacjękrzywej miareczkowania do zerowej aktywnościpapainy [6, 16].7. Oznaczanie aktywności cystatyn wobec katepsyny Bmetodą spektrofluorometryczną (wg Heidtmana)Tu również oznacza się całkowitą aktywność inhibitorową,ale zamiast papainy dodaje się oczyszczonąludzką katepsynę B pochodzenia wątrobowego. Stężeniaaktywnego enzymu określa się poprzez stechiometrycznemiareczkowanie przy użyciu inhibitora E-64. Próbkiinkubuje się z katepsyną B w temp. 37°C w buforzefosforanowym o pH = 6,0 zawierającym 0,02 nM EDTAi DTT przez 5–10 minut. Dochodzi wtedy do powstawaniakompleksów enzym-inhibitor, a tym samym dezaktywacjienzymu. Pozostała w próbce aktywność katepsynyB odzwierciedla pośrednio aktywność inhibitoróww badanym materiale. Pomiaru aktywności katepsynydokonuje się tak jak to opisano powyżej przy użyciupapainy i porównuje z próbą kontrolną, w której zamiastmateriału biologicznego dodaje się sól fizjologiczną.Jedna jednostka aktywności inhibitorowej wobec katepsynyB jest równa jednej jednostce aktywności katepsyny[6, 16].8. Oznaczanie stężenia cystatyny C w surowicyJak wspomniano w części I niniejszej pracy udowodnionoudział proteaz cysteinowych i cystatyn wwielu procesach nie tylko patologicznych, ale równieżfizjologicznych. Najbliższa praktycznego, powszechnegozastosowania wydaje się być cystatyna C, wydzielanaprzez niemal wszystkie komórki ludzkiego organizmu wstanie zdrowia. Jej stężenie w surowicy zależy przedewszystkim od stopnia przesączania kłębuszkowego.Według wielu autorów czułość i specyficzność cystatyny Cjako markera wydolności nerek jest porównywalna lubnawet wyższa od stosowanego dotychczas stężenia kreatyniny.Najczęściej stosowane metody jej oznaczania toróżne odmiany metod z zastosowaniem cząstek opłaszczonychspecyficznymi przeciwciałami – radiometria,nefelometria, turbidymetria. Dostępne są nawet zautomatyzowanesystemy do przeprowadzania licznych i szybkichanaliz (np. nefelometr firmy Dako Ltd [cat. No. K0071;Ely, United Kingdom]) [17, 18].9. Metody immunologiczneNiektórzy badacze równocześnie z oznaczeniamibiochemicznymi katepsyn B i L i/lub cystatyn w płynachustrojowych i/lub homogenatach z materiałów tkankowychstosują techniki z użyciem przeciwciał monoklonalnych.Najczęściej wykorzystywane w tym celu metodyto immunoelektroforeza, immunodyfuzja, immunoblotting,a także badania histopatologiczne – materiałoperacyjny lub biopsyjny zamraża się, a następnie przygotowujena kriostacie cienkie skrawki poddawane reakcjomimmunochistochemicznym (np. trzystopniowatechnika peroksydazowo-antyperoksydazowa) lub immunofluorescencyjnym.Metodą tą oznacza się tylkopoziom oznaczanych markerów, a nie ich biologicznąaktywność [19, 20].10. Metody biologii molekularnejJako bardzo precyzyjne i otwierające nowe możliwościnarzędzie badawcze, metody inżynierii genetycznejstają się coraz popularniejsze także w badaniach nadproteazami cysteinowymi i ich inhibitorami. Znalazłyone zastosowanie nie tylko w oznaczeniach ilościowychcystatyn (np. określenie ekspresji mRNA CMAP – cystatin-likemetstasis associated protein [21]), ale także wpróbach opracowania eksperymentalnej terapii genowej(transfekowanie cDNA cystatyny C do wybranych klonówkomórek nowotworowych mózgu [22]).Piśmiennictwo1. Radwan-Oczko M., Ziętek M., Siewiński M., Kiliańska-Kanaffa U.: Aktywność inhibitorów proteinaz tiolowychcystatynw ślinie osób z progresywnymi chorobami przyzębia.Czas. Stomat., 1999, LII, 80–84.2. Siewiński M., Kręcicki T., Rak J. et al.: Thiol proteinase inhibitorsin saliva of patients with laryngological cancer.Diagn. Oncol., 1992, 2, 141–144.3. Saleh Y., Siewiński M., Kielan W., Ziółkowski P.: Regulationof cathepsin B, L expression in vitro in gastric cancer tissuesby egg white cystatin. J. Exp. Ther. Oncol., 2003, 319–324.4. Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quantitationof microgram quantities of protein utilizing the principleof protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248 –254.5. Lowry O.H., Rosenberg NJ., Ferr A.L., Randall R.J.: Proteinmeasurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem.,191, 193, 265–275.6. Barret A.J.: An improved color reagent for use in Barrett’sassay of cathepsin B. Anal. Biochem. J., 1976, 76, 374–376.7. Kręcicki T., Siewiński M. Serum cathepsin B-like activityas a potential marker of laryngeal carcinoma. Eur. Arch.Otorhinolaryngol., 1992, 249, 293–295.8. Heidtmann H.H., Slage U., Abrahamson M., Bencina M.,Kastelic L., Kopitar-Jerala N., Turk V., Lah T.T.: Cathepsin
381Proteazy cysteinowe oraz ich autogenne inhibitory w chorobach nowotworowychB and cysteine proteinase inhibitors in human lung cancercell lines. Clin. Exp. Metastasis, 1997, 15, 368–381.9. Barrett A.J.: Fluorometric assay for cathepsin B and H withmethylcoumarylamide substrates. Biochemistry, 1980, 187,909–912.10. Barrett A.J., Kirschke H.: Cathepsin B, cathepsin H and cathepsinL. Methods. Enzymol., 1981, 80, 535–561.11. Bohley P., Seglen PO. Protheases and proteolysis in the lysosome.Experientia, 1992, 48, 151–157.12. Pagano M., Capony F., Rochefort. Pro-cathepsin D can activatein vitro procathepsin B cecreted by ovarian cancers. C.R. Acad. Sci., II309, 7–12.13. Siewiński M.: Method of purification of urinary thiol proteinaseinhibitors (UTPI) from human urine. Cancer Biochem.Biophys., 1991, 12, 33–44.14. Siewiński M., Kręcicki T., Jarmułowicz J. et al.: Cysteineproteinase inhibitors in serum of patients with head and necktumors. Diagnostic Oncology 1993: Proceedings Third InternationalConference on Head and Neck Cancer. San Francisco,July 26–30, 1992, 247.15. Minakata K., Asano M., Sato T., Harada N.: Assay of α-cysteine protinase inhibitor in serum or plasma. Hoppe – Seyler’s.Z. Physiol. Chem., 1982, 363, 493–498.16. Siewiński M., Saleh J., Gryboś M. Et al. Determination ofcysteine peptidases-like activity and their inhibitors in the serumof patients with ovarian cancer treated by conventionalchemotherapy and vitamin E. J. Exp. Ther. Oncol., 2004, 4,189–193.17. Swan S.K.: The search continues – an ideal marker of GFR[Editorial]. Clin. Chem., 1997, 43, 913–914.18. Stowe H., Lawrence D., Newman D.J. et al.: Anatylical Performanceof o Particle-enhanced Nephelometric Immunoassayfor Serum Cystatin C using Rate Analysis. Clin. Chem.,2001, 47, 1482–1485.19. Levicar N., Strojnik T., Kos J. et al.: Lysosomal enzymes, cathepsinsin brain tumor invasion. J. Neurosurgery, 2001, 48,3, 598–605.20. Saleh J., Siewiński M., Sebzda T. et al.: Inhibition f cathepsinB activity in human breast cancer tissue by cysteine peptidaseinhibitor isolated from human placenta:immunohistochemicaland biochemical studies. Folia Histochem. Cytobiol., 2003, 3,161–167.21. Utsunomiya T., Hara Y., Kataoka A. et al.: Cystatin-like metastasisassociated protein mRNA expression in human colorectalcancer is associated with both liver metastasis and patientsurvival. Clin. Cancer. Res., 2002, 8, 8, 2591–2594.22. Konduri S.D., Yanamandra N., Siddique K. et al. : Modulationof cystatin C expression impairs the invasive and tumorigenicpotential of human glioblastoma cells. Oncogene,2002, 21, 57, 8705–8712.Adres do korespondencji:Lek. med. Agnieszka WyrwińskaKatedra Chemii i Biochemii Klinicznej AMUl. Grunwaldzka 660-780 Poznańtel. (061) 8546590fax. (061) 8546599
- Page 2 and 3:
REDAKTOR NACZELNYEDITOR IN CHIEFpro
- Page 4 and 5:
312Bartosz Sokół i innipodpotylic
- Page 8 and 9:
316Anna Bryl i inniNadmierna stymul
- Page 10 and 11:
318Anna Bryl i inniTab. 1. Wskaźni
- Page 12 and 13:
Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 320-3
- Page 14 and 15:
322Łukasz Bartkowiak i innikrotnie
- Page 16 and 17: 324Patrycja Gula, Wojmir Ziętkowia
- Page 18 and 19: 326Patrycja Gula, Wojmir Ziętkowia
- Page 20 and 21: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 328-3
- Page 22 and 23: 330Krystyna Przybyłowska i inniWyk
- Page 24 and 25: 332Krystyna Przybyłowska i inniBre
- Page 26 and 27: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 334-3
- Page 28 and 29: 336Teresa Seidler, Milena GryzaTabe
- Page 30 and 31: 338Teresa Seidler, Milena Gryzaspo
- Page 32 and 33: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 340-3
- Page 34 and 35: 342Barbara Stawińska-Witoszyńska
- Page 36 and 37: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 344-3
- Page 38 and 39: 346Irena Maniecka-Bryła, Marek Bry
- Page 40 and 41: 348Irena Maniecka-Bryła, Marek Bry
- Page 42 and 43: 350Irena Maniecka-Bryła, Marek Bry
- Page 44 and 45: 352Wojciech Kapała, Jerzy Skrobisz
- Page 46 and 47: 354Wojciech Kapała, Jerzy Skrobisz
- Page 48 and 49: 356Wojciech Kapała, Jerzy Skrobisz
- Page 50 and 51: 358Wojciech Kapała, Jerzy Skrobisz
- Page 52 and 53: 368Wiesław Kalupanych nie przejawi
- Page 54 and 55: 370Wiesław Kalupa20018016014012010
- Page 56 and 57: 372Teresa Kosicka, Hanna Kara-PerzI
- Page 58 and 59: 374Teresa Kosicka, Hanna Kara-Perz
- Page 60 and 61: 376Teresa Kosicka, Hanna Kara-Perzn
- Page 62 and 63: 2Teresa Kosicka, Hanna Kara-Perz
- Page 64 and 65: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 378-3
- Page 68 and 69: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 382-3
- Page 70 and 71: Beata Kosińska 384ocena endoskopow
- Page 72 and 73: Beata Kosińska 386ty białek osocz
- Page 74 and 75: Beata Kosińska 38821. Frewin R.J.,
- Page 76 and 77: 390Anna Wawrocka, Maciej Krawczyńs
- Page 78 and 79: 392Anna Wawrocka, Maciej Krawczyńs
- Page 80 and 81: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 394-3
- Page 82 and 83: Ewa Zeyland-Malawka, Elżbieta Prę
- Page 84 and 85: Ewa Zeyland-Malawka, Elżbieta Prę
- Page 86 and 87: 400Aleksandra Kuligowska, Grażyna
- Page 88 and 89: 402Aleksandra Kuligowska, Grażyna
- Page 90 and 91: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 404-4
- Page 92 and 93: Dominik Dytfeld i inni 406skopii (M
- Page 94 and 95: 408Marcin Wieczorek i inniratykę p
- Page 96 and 97: 410Marcin Wieczorek i inniTab. 1. S
- Page 98 and 99: 412Marcin Wieczorek i inniSchisandr
- Page 101 and 102: Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 407-4
- Page 103 and 104: INSTRUCTIONS TO AUTHORSGeneral1. No