Das Magazin - Ausgabe 03 - Systembiologie

Abbildung 2: direct stochastic optical reconstruction microscopy (d STORM) zellulärer Strukturen.
Sowohl zelluläre Strukturen (Mikrotubulin (A, B), Endoplasmatisches Retikulum (C, D)) als auch die Verteilung von Proteinen (Mitochondrien (E-G)) (van de Linde et
al., J. Struct. Biol. 2008) können mit der dSTORM-Methode hochaufgelöst abgebildet werden. Die Markierung der Proben erfolgt mittels Immunofluoreszenz und
unter Verwendung kommerziell erhältlicher farbstoffmarkierter Antikörper (Bild: Ulrike Endesfelder, Julius-Maximilians-Universität Würzburg).
zelluläre und subzelluläre Strukturen, Viren, die Zusammensetzung
molekularer Maschinen oder die genaue räumliche
Anordnung von Biomolekülen aufzulösen. Dies erklärt die hohe
Motivation mikroskopisch-interessierter und arbeitender Forschungsgruppen,
neue Verfahren zu entwickeln, die eine höhere
räumliche Auflösung als die bisheriger Verfahren ermöglichen.
Unter den verschiedenen Verfahren zur hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie
nimmt die Lokalisationsmikroskopie mit
schaltbaren Fluoreszenzsonden eine besondere Stellung ein.
Die experimentelle Durchführung ist vergleichsweise einfach.
Die erreichbare räumliche Auflösung liegt bei ~20 nm, und eine
große Bandbreite an geeigneten Fluoreszenzsonden und Markierungstechniken
steht zur Verfügung. Als Einzelmolekültechniken
liefert dieses Verfahren ein hohes Maß an quantitativer
Information. Darüber wird durch die Beobachtung einzelner Ereignisse
eine Mittelung experimenteller Parameter vermieden.
Mehrfarbenmessungen sowie die Beobachtung von dynamischen
Prozessen in lebenden Zellen sind ebenso möglich. Schließlich
sind die mit diesen Verfahren gewonnen Daten, z. B. genaue
räumliche und zeitliche Koordinaten für jedes einzelne fluoreszierende
Molekül, auch über die Darstellung von hochaufgelösten
Bildern hinaus sehr nützlich, beispielsweise zur Bestimmung
räumlicher Verteilungen („biomolecular mapping“) oder zur
Aufstellung topologischer Netzwerke.
Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie mit photoschaltbaren
Sonden
Die Lokalisationsmikroskopie vereinbart drei grundlegende
Prinzipien:
1. der Einsatz von photoaktivierbaren oder photoschaltbaren
Fluoreszenzsonden,
2. die präzise Lokalisation einzelner Fluoreszenzfarbstoffe
mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern, und
3. die zeitliche Trennung des gesamten Fluoreszenzsignals
einer Probe in einzelne Bilder (Abb. 1).
In einer zunächst „dunklen“ Probe, d. h. dass alle Sonden in
einem nicht-fluoreszierenden Zustand bzw. ausgeschaltet vorliegen,
werden in einem ersten Schritt wenige Sonden aktiviert
(angeschaltet). Dabei wird darauf geachtet, dass diese als einzelne
Moleküle voneinander räumlich getrennt detektiert werden.
Von jedem dieser Moleküle wird nun in einem zweiten Schritt
die genaue Position bestimmt. Dies geschieht durch Annäherung
einer geeigneten mathematischen Funktion an die Abbildung des
einzelnen Moleküls, und zwar umso genauer, je mehr Photonen
detektiert wurden. Bei der Detektion von 1.000 Photonen liegt diese
Genauigkeit