Das Magazin - Ausgabe 03 - Systembiologie

Abbildung 3: Lokalisierung der polar lokalisierten Proteine PIN1 (grün) und PIN2 (rot) in mechanisch gekrümmten Arabidopsis-Wurzeln (A). Durch die Umordnung
der PIN-Proteine kommt es zu einem mikroskopisch nachweisbaren Stau des Hormons Auxin, der mithilfe eines rosa gefärbten Auxinreporters in transgenen
Linien, die das Konstrukt PIN1::PIN1- GFP, pDR5rev::3XVenus-N7 enthalten, nachgewiesen werden kann (Copyright: PNAS).
Proteinen sowie die zeitliche und räumliche Skalierbarkeit
einzelner Reaktionsschritte über viele Zellen mit meist schnellem
Informationsaustausch aus. Schnappschüsse wie die hier
beschriebene Reaktion auf mechanische Reize geben einen ersten
Einblick in das komplexe Reaktionsgeschehen, bilden aber
die Signalvorgänge nur unvollständig ab. Einzig dynamische,
bildgebende Verfahren können eine nahezu ungestörte Beobachtung
und Analyse von Lebensprozessen in einzelnen Zellen
leisten. Innovative optische Verfahren sind daher notwendig,
um komplexe Lebensprozesse und Reaktionskaskaden besser
verstehen zu können. Die enge Verbindung von Molekularbiologie
und optischer Gerätetechnologie ermöglichte es uns,
neue Verfahren zu entwickeln und in eine innovative Lichtmikroskopie-Plattform
zu integrieren. Diese „4D Analyzer“
genannte automatisierte Mikroskop-Plattform kombiniert die
räumlich (3D) und zeitlich (+1D) aufgelöste Bildaufnahme mit
automatisierter intelligenter Bildauswertung. Im Vordergrund
steht die vollautomatische Durchführung von Experimenten
mit lebenden Zellen in Echtzeit, mit höchster Aufnahmegeschwindigkeit
bei minimierter Probenschädigung und einem
Abbildung 4: Visualisierung der Zellkerne in der
Spitze der Arabidopsis-Wurzel
maximalen Probendurchsatz für ein breites Spektrum von
Anwendungen, die bisher mehrere Messstände erforderlich
machten. Das integrierte Design ermöglicht Umschalten zwischen
verschiedenen Anwendungen wie FRET, FRAP, strukturierter
Beleuchtung, TIRF und Weitfeld-Fluoreszenz innerhalb
von Millisekunden und kombiniert diese mit Online-Analysen
und Schnittstellen für die Bild-Nachbearbeitung und Visualisierung
von mehrdimensionalen Datensätzen. Die resultierende,
bis dahin unerreichte Leistung des voll automatisierten
Systems ermöglicht die Erfassung und Visualisierung zellulärer
Strukturen und Funktionen in Echtzeit und die räumliche 3D
Visualisierung von Molekülen in den Signalkaskaden, in die sie
involviert sind. Nach Abarbeitung komplexer Messprotokolle
an einer Vielzahl von Stellen in der Probe ist es möglich, mit
hoher Reproduzierbarkeit wieder an beliebige Punkte in der
Probe zurückzukehren und dadurch an vielen Stellen parallele
Langzeitbeobachtungen durchzuführen. 3D- und 4D-Mustererkennungsalgorithmen
in Verbindung mit selbstlernenden
Strategien für intelligente Segmentation ermöglichen eine
statistisch untermauerte, quantitative Analyse von Datensätzen
(Schulz et al., 2006). Dies führte zur Entwicklung eines
intrinsischen Koordinatensystems der Arabidopsis-Wurzel und
ermöglicht den direkten quantitativen Vergleich der Zellen
verschiedener Wurzeln (Schmidt, Pasternak et al., 2011; in Vorbereitung
– Abb. 4).
Copyright Springer-Verlag
Bei der Konzeption der „4D Analyzer“-Plattform achteten wir
darauf, die Probenbelastung durch das Beobachtungslicht in jeder
Phase der Messungen minimal zu halten. Nur so konnten wir
sicherstellen, dass keine Artefakte beobachtet werden und dass
die Proben auch bei Langzeitbeobachtungen in einem möglichst
nativen Zustand verbleiben. In diesem Zusammenhang gilt es jedoch
eine Art „biologische Unschärferelation“ zu beachten: jede
Beobachtung eines biologischen Systems stellt eine Beeinträchtigung
dieses Systems dar, und diese Beeinträchtigung nimmt mit
zunehmender Messgenauigkeit und mit zunehmender Zeitauflösung
zu. Beispielsweise ergibt zwar eine konfokale Messung,
d.h. die Ausleuchtung eines kleinen Ausschnitts der Probe durch
einen wandernden Lichtpunkt, eine bessere 3D-Auflösung als
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