Das Magazin - Ausgabe 03 - Systembiologie

Entscheidend für Lokalisationsverfahren sind sowohl geeignet
schaltbare Fluoreszenzsonden, als auch Markierungstechniken.
Während fluoreszierende Proteine genetisch an ein Zielmolekül
angebracht werden können, benötigen organische Farbstoffe
spezifische Markierungstechniken. Hierzu zählen die Markierung
mit Antikörpern oder der Einsatz spezifischer Moleküle (z. B.
Phalloidin zur Markierung von Actin) in fixierten Zellen, sowie
eine Vielzahl an spezifischen Tag-Technologien, die eine gezielte
Markierung von Biomolekülen mit organischen Farbstoffen ermöglichen.
Lokalisation einzelner Moleküle: Mehr als Bilder
Unter den hochauflösenden Mikroskopieverfahren nimmt die
Lokalisationsmikroskopie eine Sonderstellung ein, da im Experiment
zunächst von jedem einzelnen Fluoreszenzfarbstoff sowohl
die zeitlichen als auch die Nanometer-genauen räumlichen Koordinaten
bestimmt werden. Aus diesen primären Daten können
nun hochaufgelöste Bilder durch Rekonstruktion erzeugt werden
(Abb. 2). Darüber hinaus können Einzelmolekül-Lokalisationen
mit verschiedenen Algorithmen auf ihren zeitlichen oder räumlichen
Abstand analysiert werden und somit beispielsweise
biomolekulare Cluster oder Bewegungspfade einzelner Moleküle
errechnet werden (Abb. 3).
Photoschaltbare Sonden und Single-Particle
Tracking
Die Untersuchung der Dynamik und Mobilität von Biomolekülen
als auch intermolekularer Wechselwirkungen kann wertvolle experimentelle
Daten für die Erstellung oder Überprüfung systembiologischer
Modelle liefern. Ein interessanter und neuer Ansatz
hierfür ist der Einsatz photoschaltbarer Sonden in Kombination
mit Single-Particle Tracking (SPT). Der entscheidende Vorteil
gegenüber den „klassischen“ Verfahren ist, dass ein großer Vorrat
an nicht-aktivierten Sonden vorhanden ist, aus welchem zu
jeder Zeit nur ein kleiner Teil aktiviert und als einzelne Moleküle
verfolgt wird. Auf diese Weise kann ein Experiment an einer lebenden
Zelle über eine lange Zeit (viele Minuten) durchgeführt
werden, mit einer Zeitauflösung im Bereich weniger Millisekun-
Abbildung 3: Einzelmolekül-Lokalisationsdaten
Sebastian Malkusch, Julius-Maximilians-Universität Würzburg
Neben der Generierung hochauflösender Bilder (links)
können Einzelmolekül-Lokalisationsdaten auch mit
topologischen und morphologischen Algorithmen
verarbeitet werden (unten), und auf diese Weise biomolekulare
Assemblierungen oder Cluster quantifiziert
werden. Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Beobachtung
dynamischer Prozesse in lebenden Zellen
(rechts) über Einzelmolekültrajektorien.
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Forschung Fluoreszenznanoskopie mit schaltbaren Fluoreszenzsonden
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