Das Magazin - Ausgabe 03 - Systembiologie

AG Nalbant. Von links nach rechts: Diana Moser, Nina Schulze, Olga Müller, Perihan Nalbant, Vera Schultz, Melanie Gräßl, Johannes Koch, Bettina Wagner
(Foto: Perihan Nalbant).
pungen, wohingegen RhoA für die Bildung und Organisation
der kontraktilen Aktinfasern und somit für den Aufbau von
Zugkräften essentiell ist. Cdc42 wird schließlich mit der Generierung
von antennenartigen Ausstülpungen, den sogenannten
Filopodia, in Verbindung gebracht und ist für die Richtungsfindung
während der Migration essentiell. Die Rho-GTPasen selbst
sind in der Zelle nicht permanent und überall aktiv: Vielmehr
können sie wie molekulare Schalter ein- oder ausgeschaltet
vorliegen. Dabei wird die räumliche und zeitliche Aktivierung
dieser Schalterproteine wiederum durch ein komplexes Zusammenspiel
anderer übergeordneter Proteine und eine fein
abgestimmte gegenseitige Kontrolle der drei Rho-GTPasen
untereinander definiert. Die Mechanismen, die diese wechselseitigen
Interaktionen die Dynamik der Zellmigration koordinieren,
sind jedoch nicht bekannt.
Messung und Manipulation der Aktivität von Rho-
GTPasen
Zum besseren Verständnis der molekularen Zusammenhänge
haben wir und unsere Kooperationspartner Fluoreszenz-basierte
Biosensoren entwickelt, welche die Visualisierung der zellulären
Verteilung von aktivierten Rho-GTPasen in einzelnen lebenden
Zellen erlauben (Kraynov et al., 2000; Nalbant et al., 2004, Pertz
et al., 2006). Die Funktionsweise dieser Biosensoren basiert im
Wesentlichen auf der lokalen Änderung von Fluoreszenzsignalen
in Abhängigkeit von der vorhandenen Menge an aktivem Protein
(Abb. 2). Die präzise Messbarkeit solcher lokalen Aktivitäten
in der Zelle erlaubt die zeitliche und räumliche Korrelation der
betrachteten Proteinfunktionalitäten mit dem dynamischen Aufund
Abbau von zellulären Strukturen während des Migrationsvorgangs
(Machacek et al. 2009, Nalbant et al., 2009).
Abbildung 2: Zwei unterschiedliche Prinzipien von Biosensoren zur Visualisierung von aktiven Rho-GTPasen
in lebenden Zellen
Bild: Perihan Nalbant
A) Dieser Biosensor basiert auf dem photophysikalischen Prozess des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET): Zur Detektion wird unter dem Mikroskop
blaues Licht (458 nm) auf die Probe eingestrahlt. Die Energie dieses Lichtes wird von einem Teil des Moleküls aufgenommen (CFP). Im inaktiven Zustand der
Rho-GTPase wird die aufgenommene Energie hauptsächlich in Form von türkisfarbenem Licht (476 nm) wieder abgeben. Wenn das Rho-Protein aktiv ist, verändert
sich die Gesamtstruktur des Sensors. Durch diese Strukturänderung kommen sich die beiden Fluorophore (CFP und YFP) im Sensor näher. In Abhängigkeit
von diesem Abstand kann Energie zwischen den Fluorophoren übertragen werden, wodurch Licht der Wellenlänge 527 nm generiert wird (gelbes Licht). Durch
die mikroskopische Aufnahme der Zelle und Messung von Licht dieser Wellenlängen kann die räumliche und zeitliche Verteilung des aktiven Rho-Proteins in der
Zelle gemessen werden (Pertz et al., 2006). Die Aktivität ist in Falschfarben dargestellt: Wärmere Farben repräsentieren erhöhte Aktivierung.
B) Der Biosensor zur Messung der Cdc42-Aktivität besteht aus einem Proteinfragment, welches nur die aktive GTPase binden kann. Das Fragment ist mit einem
Fluorophor gekoppelt, welches bei einer Interaktion mit der aktiven GTPase auf die Änderung seines Milieus mit einer starken Veränderung seiner Fluoreszenzintensität
reagiert. Die mikroskopische Messung der Fluoreszenzmenge in unterschiedlichen Zellbereichen, erlaubt somit die Visualisierung der korrespondierenden
Menge und Verteilung des aktiven Cdc42 Proteins (Nalbant et al., 2004).
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