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128 G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl www.gimle.fsm.it fluorescenza limitando, così, la visualizzazione con la microscopia convenzionale. La streptavidina (Str) è una proteina tetramerica di peso molecolare 64-kDa, con un diametro di 5nm e che usa sulla sua superficie amine per poter adsorbire come un’elica sulle pareti dei CNT pristini (8). In questa ricerca abbbiamo voluto vedere se potevamo decorare SWNT con QD coniugati con la steptavidina (SW-Str-QD) ed eventualmente quali fossero le capacità endocitosiche di tale complesso nelle cellule Jurkat T leucemiche. MATERIALI E METODI Sono stati utilizzati SWNT pristini, Str-QD, αCD3 con biotina e non coniugati, siero di topo normale, siero di capra normale, anticorpi antitopo, mezzi di cultura cellulare con alta quantità di glucosio, siero fetale di bovino, formaldeide poli-L-lisina coniugata a concavalina A, dimetil formaldeide, Triton x-100, PBS e cellule Jurkat T leucemiche. I SWNT sono stati dapprima sonicati per dar loro una uniforme dispersione. Poi 100 µg di questa dispersione è stata lavata 5 volte con PBS. Il precipitato è stato disperso in Str-QT PBS, sonicati, filtrati e dispersi di nuovo in PBS. Le immagini Str-QD e SWNT-Str-QD sono state evidenziate usando microscopio a fluorescenza e microscopio elettronico. RISULTATI Nella Figura 1 sono riportate le fotografie dei SWNT pristini (A), del complesso disperso SWNT-Str-QD (B) ed uno schema che evidenzia l’interazione tra i recettori di membrana CD3 sulle cellule Jurkat T leucemiche ed il complesso SWNT-streptavidina-quantum dot (C). Nella Figura 2 sono riportate le immagini di Str-QD in PBS usando il microscopio ottico (A) e confocale (B). Nella Figura 3 sono riportate le immagini al microscopio ottico (A), confocale (B) e al microscopio elettronico di SWNT-Str-QD (C). Figura 1 Figura 2 Figura 3 DISCUSSIONE Il campo emergente della nanomedicina, usando nanoassemblati ultramolecolari a paragone di molecole piccole attualmente in uso, può permettere lo sviluppo di mezzi più idonei per la diagnosi e il trattamento di malattie maligne. Perché sia accresciuta la loro efficacia diagnostica o terapeutica, questi nanoassemblati ultramolecolari devono essere realizzati tali da funzionare in ambienti biologicamente rilevanti ed avere una capacità di carico multivalente in modo da poter evidenziare con facilità una cellula o trasferire in essa un medicamento. Nell’ultima decade sono stati preparati e testati diversi tipi di nanoparticelle per vari tessuti target. Ma pochissimi articoli sono stati pubblicati riguardo la loro citotossicità. Tali studi hanno preso in considerazione essenzialmente i SWNT pristini (cioè senza alcuna funzionalizzazione chimica) mettendo alla luce la loro possibile tossicità. Poco si sa sulla tossicità dei SWNT in seguito a trattamenti chimici, in particolare in seguito ad ossidazione con acidi forti, che arricchendo le loro punte e le loro pareti di gruppi carbossilici li rendono disperdibili in soluzioni acquose ed ottime basi per ulteriori manipolazioni chimiche. Molti autori hanno mostrato come sia possibile usare SWNT per veicolare all’interno della cellula sostanze che altresì non riuscirebbero ad oltrepassare la membrana cellulare. L’uso di SWNT in questo senso implica la loro funzionalizzazione mediante specifici gruppi chimici funzionali. L’abilità ad essere funzionalizzati e visualizzati in ambiente biologico con una semplice microscopia fluorescente ha aumentato la loro potenzialità come nanoprobi biologici. Ma prima di tutto essi devono essere purificati. Infatti,il materiale appena prodotto presenta impurezze carbonacee (grafite, carbon black, etc.) e particelle metalliche provenienti dai catalizzatori utilizzati (nickel, ittrio, cobalto, etc.) In questa ricerca abbiamo voluto vedere se il complesso SWNT-Str- QD può essere usato come nanoprobe fluorescente ed essere introdotte nelle cellule Jurkart leucemiche mediante endocitosi. I complessi SWNT- Str-QD sono completamente dispersibili in PBS in contrasto con quanto accade per i pristini CNT a causa della loro natura idrofobica. Questi nanoassemblati ultramolecolari, visibili a microscopio fluorescente convenzionale, appaiono al microscopio elettronico come singoli tubi o piccoli aggregati. Per dimostrare che questi nanoassemblati luminescenti possono essere ancora funzionalizzati sia con piccole molecole che con macromolecole abbiamo sfruttato la forte affinità esistente tra la biotina e la streptavidina. Il complesso SWNT-Str-QD funziona come un nanoprobe multivalente intracellulare nelle cellule Jurkat T leucemiche nelle quali gli anticorpi CD3 (αCD3) assemblati alla biotina si legano ai loro recettori CD3R. Al microscopio confocale si vede CDR che media l’endocitosi del complesso biotina -αCD3-SW-Str-QD. I risultati suggeriscono che senza la stimolazione di CD3, o in sua assenza, l’endocitosi è debole ma è fortemente amplificata se viene mediata da CD3R assemblato a αCD3 unito alla biotina.Una volta internalizzato nella cellula, il complesso SWNT-Str-QD viene trasportato nei lisosomi. BIBLIOGRAFIA 1) Dresselhaus MS, Dresselhaus G, Eklund PC. Science of Fullerenes and Carbon Nanotubes. Academic, New York 1996. 2) Ebbesen TW. Carbon Nanotubes: Preparation and Properties. CRC, Boca Raton 1997. 3) Bianco A, Kostarelos K, Partidos CD, Prato M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chem Commun (Camb) 2005; 5: 571. 4) Shi Kam NW, Jessop TC, Wender PA, Dai H. Nanotube molecular transporters: internalization of carbon nanotube-protein conjugates into Mammalian cells. J Am Chem Soc 2004; 126: 6850. 5) Shvedova AA, Castranova V, Kisin ER, Schwegler-Berry D, Murray AR, Gandelsman VZ, Maynard A, Baron P. Exposure to carbon nanotube material: assessment of nanotube cytotoxicity using human keratinocyte cells. J Toxicol Environ Health A 2003; 66: 1909. 6) Sayes CM, Fortner JD, Guo W et al. The differential cytotoxicity of water-soluble fullerenes. Nano Letter 2004; 4: 1881. 7) Bottini M, Tautz L, Huynh H, Monosov E, Bottini N, Dawson MI, Bellucci S, Mustelin T. Covalent decoration of multi-walled carbon nanotubes with silica nanoparticles. Chem Commun (Camb) 2005; 6: 758. 8) Weber PC, Ohlendorf DH, Wendoloski JJ, Salemme FR. Structural origins of high affinity biotin binding to streptavidin.Science 1989; 243: 85-88.
G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl 129 www.gimle.fsm.it P-14 STATO DELLE CONOSCENZE SUGLI EFFETTI A DISTANZA DEL FALL-OUT RADIOATTIVO DI CHERNOBYL G. Sciannamblo, F. Caputo, S. Bruno, A. Lorusso, S. Pranzo, N. L’Abbate Sezione di Medicina del Lavoro “B. Ramazzini”, DIMIMP Università di Bari, Policlinico Piazza Giulio Cesare, 11 - 70124 Bari Corrispondenza: Prof. Nicola L’Abbate - Sezione di Medicina del Lavoro “B. Ramazzini”, DIMIMP Università di Bari, Policlinico Piazza Giulio Cesare, 11 - 70124 Bari, Italy - E-mail: n.labbate@radioprotezione.uniba.it ACTUAL KNOWLEDGE OF THE REMOTE EFFECTS OF CHERNOBYL RADIOACTIVE FALL-OUT Key words: Chernobyl nuclear power accident, cesium contamination, cardiovascular symptoms. ABSTRACT. INTRODUCTION. 26 April 2006 marked the 20 th anniversary of the accident at the Chernobyl nuclear plant in northern Ukraine. As a result of the accident an enormous quantity of radionuclides were released in atmosphere, especially I-131, Cs- 137 and Sr-90. Cs-137, with a half-life of 30 years, continues to affect the health of people living in contaminated regions. The incorporation of radiocesium induces the evolution of structural and metabolic disorders in vital organs: these modifications can be integrated into the syndrome of incorporated long-living radioisotopes. METHODS. Experimental, anatomo-pathological and clinical studies performed by the research teams showed the highest accumulation of Cs-137 in endocrine glands, in particular the thyroid, the adrenals and the pancreas. High levels were also found in the heart, the thymus and the spleen. Chronic Cs-137 levels over 50 Bq/Kg body weight is often associated with serious cardiovascular diseases in childhood and adolescence. DISCUSSION. In the coming years, the Cs-137 burden in the organism of children must be further investigated and the pathogenesis of different diseases intensively studied, also because radiocontaminated agricultural land is being increasingly cultivated and radiocontaminated food is spreading countrywide. INTRODUZIONE Il ventesimo anniversario del disastro di Chernobyl ci riporta alla necessità di indagare meglio le conseguenze a lunga distanza di quell’evento. A seguito dell’incidente furono liberati isotopi radioattivi per un’attività totale pari a 11 EBq: I 131 , Te 132 , Zr 95 , Nb 95 , Ce 141 tra gli isotopi responsabili dell’esposizione esterna, Cs 137 , Cs 134 e Sr 90 per l’esposizione interna conseguente ad ingestione di cibo contaminato. Interessante è la problematica della distribuzione di tali radionuclidi nel corpo umano al fine di avere un’idea della dose all’uomo per una data esposizione di un certo radioelemento nell’ambiente e una data concentrazione negli alimenti. Le stime di dose efficace accumulata nei 20 anni successivi all’incidente (1986-2005) per gli individui della popolazione generale variano da pochi mSv ad alcune centinaia di mSv in dipendenza di luogo, età e abitudini di vita come dieta e tempo trascorso fuori casa. La dose media efficace accumulata fino al 2000 tra i residenti delle zone a stretto controllo (con densità di deposizione di Cs 137 pari a 555 kBq m - 2) è dell’ordine dei 50 mSv, mentre nelle aree meno contaminate è dell’ordine dei 10 mSv (1) (Tabella I). L’incorporazione di radionuclidi induce lo sviluppo di disordini strutturali e metabolici negli organi vitali; queste modificazioni possono essere incluse nella cosiddetta “sindrome da incorporazione di radioisotopi di lunga durata”, ovvero la correlazione tra la presenza anche di piccole quantità di Cs 137 (50-100 Bq/Kg) nei tessuti e tutta una serie di patologie in forte crescita soprattutto nei bambini: cardiopatie, problemi renali, diminuzione della vista, depressione del sistema immunitario. Tra i radionuclidi di lunga durata, particolare attenzione è rivolta allo Sr 90 e al Cs 137 . Tabella I. Stime di dose medie efficace (mSv) per gruppi di popolazione (da E. Cardis et al 2006) Popolazione Individui coinvolti Dose media efficace (mSv) Liquidatori (1986-1987, 30 km zone) 240.000 100 Sfollati del 1986 116.000 33 Persone che vivono in arie contaminate: Densità di deposizione di 137 Cs >37 kBq m-2 Densità di deposizione di 137 Cs >555 kBq m-2 c 5.200.000 a 10 b 270.000 50 b a Comprensive di circa 1.900.000 persone della Bielorussia, 2.000.000 dalla Russia e 1.300.000 dalla Ucraina. b Per il periodo 1986-2005. c Zona a stretto controllo (inclusa nell’area con densità di deposizione >37 kBq m-2 )/ MATERIALI E METODI Da una revisione di letteratura sono emersi studi epidemiologici, clinici e anatomopatogici che indagano la patogenesi delle malattie indotte dall’incorporazione di radiocesio e, in particolare, il ruolo della concentrazione di Cs 137 nelle cardiomiopatie. In uno studio che valutava i livelli medi di Cs 137 misurati negli organi di 52 bambini residenti in aree rurali della regione di Gomel (Bielorussia) e deceduti per varie cause, sono state riscontrate le maggiori concentrazioni di tale radioisotopo nelle ghiandole endocrine, in particolare tiroide, surrene e pancreas; alti livelli si sono registrati anche per cuore, timo e milza. È stata inoltre riscontrata una stretta relazione tra le strutture e le funzioni di organi vitali in risposta alla concentrazione di radiocesio incorporato, in particolare per miocardio, reni e fegato (2). In uno studio condotto sulla popolazione del sud della Bielorussia si è riscontrato che i bambini in età scolare soffrono, oltre che di infezioni respiratorie e gastrointestinali ricorrenti, nonché di cataratta, soprattutto di dolore toracico associato a sintomi cardiovascolari come alterazione della pressione sanguigna o ipertensione arteriosa. Questi disordini funzionali del sistema cardiovascolare sarebbero riscontrati maggiormente in bambini di età compresa fra i 6 e i 10 anni (3). Bandazhevsky ha riscontrato elevate concentrazioni di Cs 137 accumulati a livello placentare e ha ipotizzato che le suddette patologie cardiovascolari riferite in bambini in età scolare possano essere causate da un danno di tale radionuclide in fase prenatale. Ha inoltre ipotizzato che se la concentrazione di tale isotopo nella placenta supera i 100Bq/kg, il feto va incontro a sofferenza da anossia con conseguente aumento del rischio di aborto. L’accumulo di radionuclidi nell’organismo di neonati allattati al seno e le cui madri vivono in zone contaminate è rapido e si protrae per tutta l’infanzia a seguito dell’assunzione di latte, vegetali e frutta provenienti da animali e terreni contaminati (4, 5). Autopsie eseguite nella regione di Gomel mostrano come malattie cardiache e casi di morti improvvise sono spesso associati ad alti livelli di Cs 137 nei miocardiociti. Studi istologici rivelano alterazioni degenerative e necrosi focali di queste cellule, con edema interstiziale. Simili cardiomiopatie sono state indotte sperimentalmente in cavie esposte a Cs 137 : questi animali di laboratorio, che hanno incorporato radionuclidi con il cibo, mostrano danni alle cellule miocardiche con modificazioni strutturali e funzionali rilevanti. Nello specifico si descrive la soppressione dell’attività di enzimi come la fosfatasi alcalina e la creatinfosfochinasi, interferendo con i processi energetici delle cellule cardiache con conseguente compromissione del loro apparato contrattile (6, 7). DISCUSSIONE L’esperienza acquisita sui danni indotti dalle radiazioni si basa su modelli sperimentali o sulle conseguenze dovute ad esplosioni atomiche (sia a scopo bellico che per test nucleari) o su pazienti sottoposti a trattamenti con radiazioni ionizzanti a scopo terapeutico. L’esperienza di Chernobyl è stata pertanto unica nel suo genere sia per le quantità di radiazioni liberate che per il numero di persone interessate direttamente o indirettamente dal fall-out. Questo significa che molti modelli sperimentali, proposti per cercare di calcolare il rischio delle popolazioni esposte, non sempre sono applicabili in questo caso.
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