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90 G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl www.gimle.fsm.it were higher among farmers (285.589±72.194 ng/ml vs. 22.366±55.142 ng/ml in controls, P=0.01). Results demonstrate that serum positivity for C. psittaci is associated with raised plasma levels of ICAMs-1. INTRODUZIONE L’infezione da Chlamydophila psittaci è comune negli uccelli e negli animali domestici. Anche l’uomo è suscettibile dell’infezione perché la C. psittaci possiede un alto potenziale zoonotico. L’infezione nell’uomo provoca una patologia definita psittacosis e si manifesta con sintomi simil-influenzali, gravi polmoniti e patologie non respiratorie a carattere sia acuto che cronico (1, 2). Studi effettuati in animali e sull’uomo hanno dimostrato che l’infezione da C. psittaci determina una risposta immunitaria sia cellulare che umorale (3). Recenti studi hanno evidenziato l’importanza dell’adesione all’endotelio microvascolare delle cellule circolanti mononucleate che favoriscono l’espressione endoteliale delle molecole di adesione, quali ELAM- 1, ICAM-1 e VCAM-1. Tali molecole determinano la diapedesi cellulare nei tessuti, svolgendo un ruolo importante nello sviluppo e nel mantenimento del processo flogistico. L’ICAM-1 facilita l’adesione delle cellule infiammatorie alle cellule endoteliali, la migrazione transendoteliale e la loro attivazione con produzione di citochine e di altre molecole effettrici. La frazione solubile dell’ICAM, definita ICAMs-1, è rilasciata nel sangue dalle cellule endoteliali e dalle cellule mononucleate nel corso di infiammazione (4). Nonostante questi risultati abbiano prospettato la potenziale utilità di tali markers endoteliali come affidabili misure di evoluzione della flogosi infettiva, non vi sono in letteratura scientifica studi che hanno valutato i livelli plasmatici delle forme solubili di tali molecole in corso di infezione da C. psittaci. Scopo del presente lavoro è stato di valutare l’associazione tra sieropositività per C. psittaci e la concentrazione plasmatica di ICAMs-1 in un gruppo di allevatori di polli che svolgevano l’attività in aziende zootecniche della Sicilia Orientale. MATERIALI E METODI Il gruppo in studio era costituito da 30 allevatori di sesso maschile, età media di 36,52±8,16 anni e anzianità lavorativa media di 12,97±3,67 anni. Il gruppo di controllo era costruito da 20 impiegati amministrativi comparabili per sesso ed età. La Tabella I riporta le principali caratteristiche degli allevatori e dei controlli. Tabella I. Principali caratteristiche degli allevatori e dei controlli Allevatori (n=30) Controlli (n=20) Età media-aa 36,52 ±8,16 37,13 ±7,24 Abitudine tabagica 17 (57%) 12 (60%) Anzianità lavorativa-aa 12,97 ±3,67 11,71 ±4,65 Patologie croniche e/o terapie Nessuna Nessuna Episodi febbrili ≤12 mesi 7 (23%) 4 (20%) Segni/sintomi di esordio febbre (7), brividi (5), cefalea (3), febbre (4), brividi (4), cefalea (1), mialgia (6), tosse (4) mialgia (4), tosse (2) Tutti i soggetti inclusi nell’indagine, previo consenso informato scritto, sono stati sottoposti ad esame clinico e prelievo di 10 ml si sangue venoso. I comuni esami di patologia clinica non hanno indicato la presenza di patologie epatiche, renali, ematologiche e dismetaboliche. La ricerca degli anticorpi anti-C. psittaci di classe IgA, IgM e IgG è stata effettuata con il metodo della immunofluorescenza indiretta (IFI). Sono state effettuate diluizioni scalari da 1:16 a 1:512. La diluizione di 1:16 è stata ritenuta il titolo discriminante dello stato di positività. Il dosaggio plasmatico dell’ICAMs-1 è stato effettuato con ELISA. L’analisi statistica è stata condotta con il programma SPSS-PC (SPSS, Italia). I dati sono stati analizzati con il test t di Student per campioni indipendenti nel confronto tra due gruppi; il test Chi-quadrato (χ 2 ) per l’analisi delle frequenze; la correlazione di Pearson per analizzare le relazioni esistenti tra le concentrazioni di ICAMs-1 e quelle degli anticorpi anti-C. psittaci. Il limite di significatività statistica è stato fissato per valori di P≤0,05. RISULTATI Nei soggetti in studio è stato evidenziato un titolo di IgG variabile da 1:16 a 1:256, mentre in tutti i soggetti del gruppo di controllo è stato evidenziato un titolo di IgG
G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl 91 www.gimle.fsm.it PHOSPHATIDYLSERINE METABOLISM DURING CHROMIUM (VI)-INDUCED APOPTOSIS IN HUMAN LYMPHOBLASTIC CELLS Key words: chromium VI, phosphatidylserine, apoptosis. ABSTRACT. Hexavalent Chromium (Cr VI) compounds, which are recognized human carcinogens, induce apoptosis with mechanisms that have not been completely clarified. Phosphatidylserine (PS) exposure toward the external surface of the membrane is a well-established event of programmed cell death; in addition, apoptotic stimuli modify PS metabolism in several cell types. Cr (VI) induces apoptosis in a human lymphoblastic cell line (MOLT-4). In this study we evaluated whether PS metabolism is modified during Cr (VI)-induced apoptosis in MOLT-4 cells, measuring the incorporation of [ 3 H]serine into PS and the conversion of newly synthesised PS into metabolically related glycerophospholipids. The apoptosis level and PS exposure were measured in parallel samples using propidium iodide solution and annexin V binding, respectively. Cell treatment with 200 µM Cr (VI) decreased the incorporation of [ 3 H]serine into PS before DNA fragmentation and PS exposure. Newly synthesized PS was decarboxylated to phosphatidylethanolamine (PE); radioactive PE/ PS ratio was decreased 6 and 12 hours after Cr (VI) treatment causing apoptosis. In conclusion, this study demonstrates that Cr (VI) treatment increases PS exposure and modifies PS metabolism in MOLT-4 cells. These events appear correlated with Cr (VI)-induced apoptosis. These findings could be relevant in elucidating the mechanism underlying Cr (VI)-induced apoptosis in MOLT-4 cells. INTRODUZIONE Il cromo è un metallo di transizione la cui evidenza di cancerogenicità è per la IARC “inadeguata per cromo metallico e composti del cromo trivalente per l’uomo”, “sufficiente per i composti del cromo esavalente”quindi classificati nel gruppo 1 (1). L’impiego del Cromo (Cr) è diffuso in molti processi industriali. Numerosi studi hanno dimostrato che a livello cellulare il Cr innesca processi ossidativi (2, 3) che danneggiano il DNA inducendo l’arresto del ciclo cellulare, l’apoptosi o la trasformazione neoplastica. Il meccanismo citotossico alla base di tali meccanismi non è tuttavia completamente chiarito. È generalmente accettato che le cellule apoptotiche espongono sulla superficie cellulare la fosfatidilserina (PS), normalmente presente sul lato citosolico della membrana, e che questo evento determini il loro riconoscimento ed eliminazione da parte dei macrofagi. Il meccanismo molecolare alla base dell’esposizione della PS non è ancora definito e potrebbe, almeno in parte, dipendere dal tipo cellulare. In alcune cellule, stimoli apoptotici causano aumento della sintesi di PS (4, 5, 6), che potrebbe contribuire alla sua esposizione. Il fenomeno non può però essere generalizzato, in quanto macrofagi indotti all’apoptosi da infezione con streptococco di gruppo B (GBS) espongono la PS pur avendo una diminuita sintesi del fosfolipide (7). Le variazioni nella sintesi di PS sopra menzionate potrebbero avere un ruolo rilevante nell’indirizzare la cellula verso la morte programmata, in quanto è nota la capacità del fosfolipide di modulare l’attività di numerose proteine implicate nella trasduzione dei segnali. Cellule linfocitarie umane (MOLT-4) sono indotte all’apoptosi in modo dose e tempo-dipendente dall’esposizione al Cr VI (8). In questo studio, abbiamo verificato se il metabolismo della PS fosse modificato, durante l’apoptosi indotta dal Cr VI, in cellule MOLT-4, misurando l’incorporazione della [ 3 H]serina nella PS e la conversione della PS di nuova sintesi nei fosfolipidi ad essa correlati. Esperimenti paralleli sono stati condotti per verificare se anche in tale modello di apoptosi venisse esposta la PS. MATERIALI E METODI Cellule MOLT-4 (ATCC N. CRL-1582) (5x10 5 cellule/pozzetto) erano poste, in doppio, in 2 ml RPMI-1640 supplementato con 20% FBS, glutamina (2 mM) e gentamicina (80 mg/l) (medium) e mantenute in atmosfera al 5% di CO 2 a 37°C. L’effetto del Cr VI sul metabolismo della PS è stato studiato incubando le cellule per diversi tempi (1, 2, 4, 6, 12 ore) nel medium contenente 30 µCi L-[ 3 H(G)]serina (S.R. 25.8 mCi/mmol,; Perkin Elmer, Boston, USA), in presenza o assenza di Cr VI, utilizzato a 2 concentrazioni (9 e 200 µM). Al termine dell’incubazione, le cellule erano centrifugate a 200xg per 10 minuti ed era valutata la radioattività nella PS. L’estrazione lipidica, la separazione dei fosfolipidi mediante cromatografia bidimensionale su strato sottile e la misura della radioattività nella PS, nella fosfatidiletanolammina (PE) e nella fosfatidilcolina (PC) erano condotte come precedentemente riportato (7). In cellule incubate nelle stesse condizioni ma in assenza di serina radioattiva veniva valutata l’apoptosi, mediante metodo del propidio ioduro (8), e l’esposizione della PS utilizzando il test per l’annessina V (Vybrant Apoptosis Assay, Invitrogen). RISULTATI Il trattamento con 200 µM Cr VI causava una diminuzione della sintesi di PS (Fig. 1A) che precedeva nel tempo l’esposizione di PS (Fig. 1B) e l’apoptosi. Quest’ultima era infatti trascurabile entro le 4 ore di trattamento ed evidente (45%) dopo 6 h di trattamento. Tempi lunghi di incubazione con Cr VI (12 ore) determinavano la necrosi cellulare. Il trattamento con 9 µM Cr VI modificava leggermente i parametri sopra riportati (a 6 e 12 ore di incubazione). L’esposizione per 6 e 12 ore con 200 µM di Cr VI, riduceva la capacità delle cellule di decarbossilare la PS neosintetizzata, valutata dal rapporto tra la radioattività nella PE e quella nella PS, non modificata invece da trattamenti per tempi o concentrazioni inferiori (9 µM). Figura 1. Effetto del trattamento con Cr VI (200 µM) sull’incorporazione di [ 3 H]serina nella PS (A) e sull’esposizione della PS (B) in cellule MOLT-4. In A, cellule MOLT-4 erano incubate con [ 3 H]serina in presenza o in assenza di Cr VI. La radioattività nella PS è espressa come dpmx10 3 /5x10 5 cellule. In B è riportata l’esposizione della PS in cellule incubate nelle stesse condizioni ma in assenza di [ 3 H]serina
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