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16 G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl www.gimle.fsm.it 5) Kühl WM, Bergsagel PL. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat Rev Cancer 2002; 2: 175-187. 6) Tafani A, Pregnolato A, Negri E et al. Diet and risk of lymphoid neoplasma and soft tissue sarcomas. Nutr Cancer 1997; 27: 256-260. 7) Gramenzi A, Buttino I, D’Avanzo B, et al. Medical history and the risk of multiple myeloma. Br J Cancer 1991; 63: 769-772. 8) Ende M. Multiple myeloma: a cluster in Virginia? Va Med 1979; 106: 115-116. 9) Sonoda T, Ispida T, Mori M, et al. A case-control study of multiple myeloma in Japan: association with occupational factors. Asian Pac J Cancer Prev 2005; 6: 33-36. 10) Demers PA, Vaughan TL, Köpsell et al. A case-control study of multiple myeloma and occupation. Am J Ind Med 1993; 23: 629-639. 11) Mester B, Nieters A, Deeg E et al. Occupation and malignant lymphoma: a population based case control study in Germany. Occup Environ Med 2006; 36: 17-26. 12) Altieri A, Chen B, Bermejo JL et al. Familial risks and temporal incidence trends of multiple myeloma. Eur J Cancer 2006:in strampa 13) Kyle RA, Finkelstein S, Elveback LR, et al. Incidente of monoclonal proteins in a Minnesota community with a cluster of multiple myeloma. Blood 1972; 40: 719-724. 14) Kyle RA, Heath Jr CW, Carbone P. Multiple myeloma in spouses. Arch Intern Med 1971; 127: 944-946. 15) Kyle RA, Greipp PR. Multiple myeloma. Houses and spouses. Cancer 1983; 51: 735-739. 16) Linet MS. Chronic lymphocytic leukaemia and multiple myeloma in husband and wife. Am J Med Sci 1984; 288: 21-24. 17) Khuder SA, Mutgi AB. Meta-analyses of multiple myeloma and farming. Am J Ind Med 1997; 32: 510-516. P-05 32 P-POSTLABELING E POLIACRILAMIDE GEL ELETTROFORESI: CONFRONTO E APPLICAZIONE DELLE DUE TECNICHE PER IL RILEVAMENTO DEGLI ADDOTTI AL DNA B. Pappalardi1 , M.V. Policastro1 , P. Chiumarulo1 , G. Assennato1 , P. Corsi2 1 Dip. di Medicina Interna e Pubblica, Sez. di Medicina del Lavoro B. Ramazzini 2 Dip. di Farmacologia e Fisiologia Umana Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Bari, Policlinico, Piazza G. Cesare 11, 70124 Bari Corrispondenza: Brigida Pappalardi - Dip. di Medicina Interna e Pubblica, Sez. di Medicina del Lavoro B. Ramazzini, Facoltà di Medicina e Chirurgia, Università degli Studi di Bari, Policlinico - Piazza G. Cesare 11 - 70124 Bari, Italy 32 P-POSTLABELING AND POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS ANALYSIS: COMPARISON OF TWO TECHNIQUES FOR THE DETECTION OF DNA ADDUCTS Key words: 32 P-Postlabeling/PAGE, addotti BPDE, TLC. ABSTRACT. BACKGROUND. 32 P-Postlabeling analysis is a powerful technique to detect DNA adducts induced by endogenous and exogenous mutagens or carcinogens. OBJECTIVES. In the present study two techniques were applied to the detection of BPDE-DNA adducts: a newly developed Postlabeling coupled with nondenaturing 20% polyacrylamide gel electrophoresis, 32 P-Postlabeling/PAGE and 32 P-Postlabeling/TLC. The aim was to consider PAGE valuable and widely useful also for biomonitoring study of exposure to PAH. METHODS. Polyethylenimine (PEI)-cellulose TLC plates were used to separate 32 P-labeled adducts two-dimensionally under several different buffer conditions; the same DNA samples were applied on nondenaturing 20% polyacrylamide gel electrophoresis for 32 P-Postlabeling/PAGE. CONCLUSIONS. While the major advantage of this technique is that many DNA samples can be analysed on the same gel and resolved in a few hours nevertheless it showed lower recoveries of BPDE-DNA adducts compared to TLC. INTRODUZIONE Il 32 P-Postlabeling/TLC è una tecnica largamente utilizzata in studi di biomonitoraggio in lavoratori esposti a contaminanti ambientali e cancerogeni. Inoltre è capace di valutare una grande varietà di addotti partendo da esigue quantità di DNA (1-5 µg) (1, 2). Nell’analisi per 32 P-Postlabeling i nucleotidi modificati e marcati in posizione idrossilica 5’ con [γ 32 P]- ATP sono caricati su lastre di polietilenimina cellulosa e migrano per cromatografia su strato sottile (TLC) (4). Di recente in letteratura è emersa una procedura di identificazione degli addotti al DNA che si basa sull’applicazione di gel di elettroforesi non denaturante al 30% poliacrilamide all’analisi del 32 P-Postlabeling ( 32 P-Postlabeling/PAGE) (5). I maggiori vantaggi di questa tecnica comprendono la possibilità di valutare più campioni di DNA caricandoli su un unico gel e una sola corsa di migrazione in tempi più brevi (6 ore). Questa tecnica offrirebbe la stessa versatilità nella rilevazione di diversi tipi di addotti e con un limite di rilevamento pari a 0,007 addotti /10 6 nucleotidi per 5 µg di DNA. Nel presente studio è stato verificata la sensibilità delle due tecniche di Postlabeling usando uno standard di DNA contenente da 0,007 addotti/10 6 nucleotidi fino a 7 addotti/10 6 nucleotidi questo allo scopo di verificare il grado di sensibilità del PAGE per future applicazioni a studi di bio-monitoraggio ambientale. METODI Campioni di DNA standard (5 µg) contenenti da 0,007 addotti/10 6 nucleotidi a 7 addotti/10 6 nucleotidi sono stati idrolizzati e marcati usando il metodo monofosfato (3). Per 32 P-Postlabelling/TLC i campioni marcati sono stati caricati su lastre di PEI e separati in due dimensioni secondo il metodo classico (4). Per 32 P-Postlabelling/PAGE i campioni venivano caricati su gel di elettroforesi non denaturante al 20% di poliacrilamide e fatti migrare in tampone TBE (5). Per entrambi i metodi gli addotti al DNA venivano analizzati mediante acquisizione al Phosphor Imager STORM 820 (Amersham). RISULTATI I campioni di DNA standard utilizzati per i due metodi di Postlabeling, sono stati ottenuti aggiungendo a 5 µg di DNA genomico umano quantità scalari di dG-BPDE in modo da ottenere 7 addotti/10 6 dNp, 0,7 addotti/10 6 dNp, 0,07 addotti/10 6 dNp, 0,007 addotti/10 6 dNp rispettivamente. I campioni così preparati davano due spots visibili sia sul gel che sulle lastrine di TLC/PEI, Figura 1. Dall’analisi con il Phosphor Imager risultavano valori di addotti pari al 12% del valore iniziale per il PAGE e al 50% per la TLC, (Correlation test, r 2 =0,9159), Tabella I. Tabella I. 32 P-Postlabeling PAGE TLC r 2 7 addotti/10 6 dNp 0,695±0,45 3,515±1,245 0,9159 0,7 addotti/10 6 dNp 0,115±0,085 0,380±0,020 0,07 addotti/10 6 dNp 0,004±0,001 0,058±0,041 0,007 addotti/10 6 dNp 0,001±0,0002 0,001±0,0002 Figura 1. Determinazione degli addotti BPDE-DNA secondo la tecnica del 32 P-Postlabeling/PAGE (A) e del 32 P-Postlabeling/TLC (B). N.1=0,007; N.2=0,07; N.3=0,7; N.4=7 addotti /10 6 dNp.
G Ital Med Lav Erg 2006; 28:3, Suppl 17 www.gimle.fsm.it DISCUSSIONE Dai risultati preliminari ottenuti è emerso che il PAGE non mostra un elevato grado di sensibilità nella rilevazione degli addotti BPDE. Rispetto alla tecnica tradizionale sono state determinate basse percentuali di recupero degli addotti tuttavia i valori ottenuti con il PAGE correlano bene con quelli della TLC. Per la sua convenienza pratica si potrebbe pertanto considerare l’applicazione di questa tecnica in sostituzione della TLC. BIBLIOGRAFIA 1) Gupta RC, Reddy MV, Randerath K. 32P-postlabeling analysis of non radioactive aromatic carcinogens-DNA adducts. Carcinogenesis, 1982; 3: 1081-1092. 2) Gupta RC. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res 1985; 45: 5656-5662. 3) Hemminki K, Yang K, Rajaniemi H, Tyndyk M, Likhachev A. Postlabelling-HPLC analysis of lipophilic DNA adducts from human lung. Biomarkers 1997; 2: 341-347. 4) Izzotti A. Detection of modified DNA nucleotides by postlabeling procedures. Toxicology Methods 1998; 8: 175-205. 5) Terashima I, Suzuki N, Shibutani S. 32P-postlabeling/polyacrylamide gel electrophoresis analysis: application to the detection of DNA adducts. Chem Res Toxicol 2002; 15 (3): 305-311. P-06 ESPOSIZIONE PROFESSIONALE A SOSTANZE CON ATTIVITÀ ENDOCRINA E VALUTAZIONE DEL RISCHIO PER LA SALUTE DEI LAVORATORI E. Barbassa1 , L. Frusteri2 1 INAIL - Direzione Regionale Lombardia, CON.T.A.R.P., Corso di Porta Nuova, 19 - 20121 Milano 2 INAIL - Direzione Generale, CON.T.A.R.P. Centrale, Via R. Ferruzzi, 40 - 00143 Roma Corrispondenza: Dr.ssa Elisabetta Barbassa - INAIL, Direzione regionale Lombardia, CON.T.A.R.P., Corso di Porta Nuova, 19 - 20121 Milano, Italy - Tel. 02-62586005, Fax 02-62586004, E-mail: e.barbassa@inail.it OCCUPATIONAL EXPOSURE TO ENDOCRINE DISRUPTING CHEMICALS AND RISK EVALUATION FOR THE WORKERS HEALTH Key words: endocrine disrupting chemicals, occupational exposure, epidemiological studies. ABSTRACT. The “Endocrine Disrupting Chemicals” (EDC) are an heterogeneous chemicals group, including polychlorinated biphenyls (PCBs), dioxins, some pesticides, alkylphenols, phthalates, polibrominated flame retardants, some heavy metals and organic solvents, which are able to interfer through different mechanisms (receptor-mediated, metabolic) with the endocrine system, causing alterations of reproductive and development processes and metabolic diseases. Aims of the current work were the analysis of the main epidemiological and toxicological studies that allowed to evaluate the occupational exposures to the Endocrine Disrupting Chemicals and to point out the adverse effects on the reproductive system caused by the EDCs and to underline the importance, in order to protect the workers health, to increase the prevention measures. INTRODUZIONE Molte sostanze chimiche sia di sintesi che naturali, ampiamente diffuse negli ambienti di vita e di lavoro e negli alimenti, possono interferire col sistema endocrino producendo una serie di effetti avversi sulla salute umana, quali: alterazioni dello sviluppo e della funzionalità dell’apparato riproduttivo sia maschile che femminile con problemi di infertilità, incremento di abortività precoce, aumentata incidenza del carcinoma alla mammella ed ai testicoli, alterazioni del sistema immunitario e neurologico, sviluppo di patologie metaboliche. Le sostanze chimiche con potenziale attività endocrina comprendono: contaminanti organici persistenti (POPs), quali policlorobifenili (PCB), diossine; gruppi di pesticidi usati in agricoltura, quali: insetticidi organoclorurati (aldrin, dieldrin, DDT,etc.), fungicidi (etilenbisditiocarbammati, vinclozolin etc.) ed erbicidi; sostanze di largo uso industriale, tra cui: alchilfenoli, ftalati, ritardanti di fiamma polibromurati, metalli pesanti (Cd, As, Cr) e solventi organici (stirene, xilene etc.); i fitoestrogeni (flavoni, isoflavoni), sostanze naturali presenti nei vegetali (es. soia). Scopo del presente lavoro è stato quello di analizzare i principali studi epidemiologici che hanno evidenziato gli effetti avversi dell’esposizione ad EDCs (Endocrine Disrupting Chemicals) in ambito lavorativo e di porre in rilievo l’importanza, per la tutela della salute dei lavoratori, di aumentare e migliorare le misure di prevenzione. MATERIALI E METODI Si sono consultate le principali banche dati di tipo biomedico e tossicologico (MEDLINE, TOXLINE, DART - ETIC, etc.) che hanno permesso di selezionare le pubblicazioni scientifiche più significative che, a partire dagli anni ’80, hanno avuto per oggetto lo studio dell’esposizione in ambito lavorativo ad EDC e degli effetti avversi causati. In particolare le tematiche di ricerca oggetto di approfondimenti sono state: – studi epidemiologici di tipo caso – controllo (retrospettivi), di coorte (prospettici) ed incrociati condotti su popolazioni lavorative esposte ad EDC; – studi tossicologici in vivo sugli animali da laboratorio e studi sperimentali in vitro su colture cellulari allo scopo di indagare gli effetti tossici ed i meccanismi d’azione degli EDC; – valutazione dell’esposizione lavorativa mediante misure di monitoraggio biologico di EDCs o loro metaboliti eseguite sui fluidi biologici di lavoratori esposti e, per le esposizioni pregresse, attraverso la consultazione di banche dati sui profili d’uso; – individuazione, ove possibile, di biomarcatori di esposizione professionale ad EDCs. RISULTATI Gli studi epidemiologici riguardanti lavoratori esposti ad EDCs sono piuttosto limitati a causa della difficoltà nel predisporre un accurato disegno epidemiologico derivante dalla contemporanea ampia diffusione degli EDCs anche negli ambienti di vita. Nell’ambito di un progetto di ricerca dell’Istituto Superiore di Sanità che ha condotto un’indagine retrospettiva (1) sulla vita riproduttiva di 3 gruppi di lavoratori con diversi livelli di esposizione a pesticidi potenziali EDCs (agricoltori in possesso del patentino per l’uso di antiparassitari con esposizione media e discontinua, lavoratori in serra con esposizione alta e continua e lavoratori dei centri di disinfestazione con esposizione massima) sono emersi ritardi significativi nel concepimento (di oltre 6 mesi) fra i lavoratori in serra che effettuavano più di 100 applicazioni all’anno di pesticidi (Odds Ratio: 2.4; Intervallo di Confidenza 95%: 1.2- 5.1) rispetto agli agricoltori ed alla popolazione di riferimento. Gli agricoltori mostravano un modesto aumento, non significativo, rispetto ai controlli presumibilmente perché sono esposti ai pesticidi in modo intermittente. Un altro studio epidemiologico incrociato (2) ha consentito di evidenziare che le mogli dei lavoratori in serra che hanno dichiarato di utilizzare al momento delle gravidanze almeno uno dei principi attivi identificati come EDCs (in particolare atrazina, benomil-carbendazim, carbaril) hanno sperimentato un rischio di aborto spontaneo circa 12 volte maggiore rispetto al gruppo di controllo costituito dai lavoratori delle serre che non utilizzavano tali sostanze. I dati degli studi epidemiologici pongono quindi in evidenza come una significativa esposizione paterna a pesticidi tossici per la riproduzione possa indurre un danno alle prime fasi embrionali, evidenziato innanzitutto dall’aumentato tasso di abortività nelle mogli. L’attività endocrina di alcune classi di pesticidi (insetticidi organoclorurati, fungicidi) è stata confermata da studi tossicologici in vivo condotti sui roditori. Le misure di monitoraggio biologico dei tossici riproduttivi effettuate sulle diverse matrici biologiche (sangue, urina e liquido seminale) dei la-
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