Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 100
6.3 Auswertung der RT-PCR- und „Twitching motility“-Ergebnisse
6.3.1 Bewertung der RT-PCR-Untersuchung von pilN im Verhältnis zu gyrA
Wie den CT-Werten in Kap. 5.5.1 zu entnehmen ist, zeigt sich die pilN-cDNA im Vergleich
zur gyrA-cDNA sowohl im Wildtyp als auch in der flaR - -Mutante stets auf nahezu gleichem
Niveau der Ausgangskonzentration. Maximal wird ein CT-Unterschied von einem Zyklus
erreicht (beim Wildtyp in der stationären Phase), was einer doppelten Ausgangsmenge an
cDNA des pilN-Gens (CT-Wert: 22,7) im Vergleich zum gyrA Gen (CT-Wert: 23,8)
entspricht. In der stationären Phase ist dieser Befund auch nicht weiter verwunderlich, da der
Pilus als beschriebener Virulenzfaktor erst in der transmissiven Phase, also der stationären,
zur Expression kommt – wie auch von Brüggemann et al. [2006] postuliert. Daher geht die
Annäherung der Transkriptomwerte bzw. der Expressionsstärke der pilN-mRNA an die Werte
des Haushaltsgens gyrA in dieser Wachstumsphase konform mit den bisher bekannten
Annahmen zum Zeitpunkt der Expression des TypIV-Pilus in Legionella pneumophila Corby.
Auch Liles Untersuchungen von mRNA-Produkten eines anderen an der Biosynthese des
TypIV-Pilus beteiligten Operons sind in der stationären Phase (nach 72 Std. Wachstum)
ausgearbeitet worden [Liles et al., 1998].
Demgegenüber stehen allerdings die Ergebnisse der RT-PCR aus der exponentiellen
Wachstumsphase beider Legionellen-Stämme. Auch in dieser Phase sind die CT-Werte und
damit die Ausgangskonzentration der mRNA von pilN und gyrA annähernd gleich (s. Kap.
5.5.1). Das könnte einerseits bedeuten, dass zumindest das pilN-Gen (damit einhergehend
wohl aber auch das gesamte pil-Operon) nicht erst in der virulenten Phase exprimiert wird,
sondern bereits in der exponentiellen Phase die gleichen Expressionswerte erlangt wie das
Haushaltsgen gyrA und auch zur stationären so gut wie keinen Unterschied zeigt.
Andererseits könnte es auch sein, dass ein unspezifisches Produkt amplifiziert wurde,
wenngleich die Amplifikate nach der RT-PCR auf einem Agarosegel zumindest die korrekte
Größe des zu amplifizierenden pilN (ca. 225 Bp) zeigen. Der Farbstoff SYBR ® Green würde
aber auch in dem Fall der unspezifischen Amplifikation an die so gebildete doppelsträngige
DNA binden.
Womöglich ist das gyrA-Gen in L. pneumophila für die relative Quantifizierung auch nicht
besonders geeignet, ähnlich wie Eleaume und Jabbouri [2004] vom gyrA aus Staphylococcus
aureus berichten. Es könnte also sein, dass die Expression von pilN insgesamt als sehr gering
anzusehen wäre, weil auch das gyrA-Gen nur auf sehr niedrigem Niveau exprimiert wird. Das