Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 80
einen das Histidin-Fusionsprotein und zum anderen das Protein mit gespaltenem 6-fach-
Histidin-Tag, welches lediglich N-terminal drei zusätzliche Aminosäurereste trägt, verwendet.
5.4.1 Kristallisationsbedingungen
Mit beiden Proteinvarianten ist in unterschiedlichen Konzentrationen (5-10 mg/ml) zunächst
mit Hilfe des Kristallisationsroboters eine Übersicht verschiedener kommerzieller und selbst
erstellter Kristallisationsbedingungen angelegt worden. Dabei sind zwei Bedingungen
ermittelt worden, die kleine Kristalle hervorgebracht haben (s. auch Kap. 4.9.1):
0,2 M Natriumcitrat, 0,1 M HEPES pH 7,5, 20 % Isopropanol (1) und
0,2 M Magnesiumchlorid, 0,1 M HEPES pH 7,5, 30 % Isopropanol (2).
Manuell reproduzieren in sog. „sitting drop“-Platten ließen sich allerdings nur Kristalle
zusammen mit Natriumcitrat. Die pH-Wert-Bedingungen waren dabei nicht allzu stringent,
sondern konnten sich über den Bereich von 7,0 bis hin zu 10,0 erstrecken. Isopropanol musste
in einer Konzentration von mindestens 18 %(v/v) bis maximal 24 %(v/v) zugegen sein, um
Kristallwachstum zu generieren. Alle Versuche, diesen Präzipitanten gegen einen weniger
oder gar nicht flüchtigen Stoff wie etwa Polyethylenglykol, Methylpentandiol, tert-Butanol,
Ethylen etc. auszutauschen, schlugen fehl. Die anfänglich kleinen Kristalle (max. 0,05 x 0,04
x 0,04 mm 3 , s. Abb. V.22) konnten letztlich nach diversen Optimierungsversuchen durch den
Zusatz von Glycerin (1-2 % v/v) auf eine Länge von etwa 0,25-0,4 mm gebracht werden (s.
Abb. V.23).
Abb. V.22 PilN mit 6-fach Histidin-Tag in kristalliner Form. Die Kristalle haben eine fast hexagonale Form,
meist jedoch mit abgeflachter Unterseite, mit der sie am Boden haften. Kristallisationsbedingungen: 0,2 M
Natriumcitrat, 0,1 M Tris, pH 8,5, 22 %(v/v) Isopropanol, gelagert für 3-5 Tage bei RT. Die Kristalle zeigen
ein Ausmaß von maximal 0,05 x 0,04 x 0,04 mm 3 .