Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 78
Abb. V.19 Elutionsprofil von PilN ohne die putative TMH an
einer FPLC-Anlage. Die rote Spur zeigt die UV-Linie bei 280
nm, die blaue den Gradienten, die braune die Konduktivität.
In Abb. V.19 verläuft der Imidazol-
Gradient von 7 % ansteigend auf
100 % in 30 min. Nur ein einzelner
großer Peak ist zu erkennen, in
dem sich überwiegend das
rekombinante PilN ohne die
potentielle
Transmembran-Helix
(TMH) befindet. Das wurde auch
erneut durch einen Westernblot der
aufgesammelten
Fraktionen
bestätigt. Das Volumen der
zusammengelegten
Fraktionen
wurde über Ultrafiltrationszellen
oder Zentrifugalfilter eingeengt und für die anschließende Gelfiltration vorbereitet. Dort
zeigte sich ein ähnlich sauberes Elutionsprofil wie bereits bei der Elution aus der HiTrap-FF-
Säule. Um auch noch bezüglich der Partikelverschmutzung und der Verteilung von
Partikelgrößenklassen Aussagen treffen zu können, ist die konzentrierte Proteinprobe nach
Zentrifugation mittels der Dynamischen Lichtstreuung (DLS) untersucht worden. Die
Messungen ergaben für das PilN-Protein ohne TMH einen monodispersen Peak (s. Abb.
V.20). Das bedeutet, dass das Protein in nur einer Größenordnung (z. B. Monomer, Di-, Tri-,
oder Oligomer) vorliegt. Dabei lassen der hydrodynamische Radius von ca. 6 nm und der
Vergleich mit anderen Proteinen gleichen Partikeldurchmessers, deren quartäre
Organisationsebene bekannt ist, und die in ähnlicher Pufferviskosität vorliegen, die
Abb. V.20 DLS-Spektrum vom PilN-Protein ohne
dessen putative TMH. Über 14 Messungen
hinweg zeigt sich ein stabiler, unimodularer
hydrodynamischer Radius von ca. 6 nm.
Vermutung einer Dimerbildung zu. Unterstützt
wird diese Annahme von den Ergebnissen der
Gelfiltration. Mit Proteinen bekannter Größe
lässt sich die jeweilige Säule kalibrieren und
daraufhin eine Molekularmassen-Bestimmung
anhand folgender Formel festlegen:
K av =(V R -V 0 )/(V C -V 0 )
V 0 beziffert das Todvolumen der Säule.
V C bezeichnet das Bettvolumen der Säule.
V R beziffert das Elutionsvolumen des Proteins.
Alle Angaben werden in ml gegeben. Dabei ist