Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 89
Die Auswertung der Massenspektren, also die Überprüfung der identifizierten Proteine, lässt
sich mit der Gelelektrophorese einfacher gestalten als bei der PF-2D. Der IEP der Proteine
steht bei beiden Techniken zur Verfügung, aber das Molekulargewicht, welches ebenfalls zur
Verifizierung der identifizierten Proteine herangezogen werden sollte, kann bei der
Elektrophorese genutzt werden. Bei der Hochdruckchromatographie muss wegen des
Trennprinzips der Hydrophobizität noch eine eindimensionale SDS-PAGE zur Klärung des
Molekulargewichts gefahren werden, da die Hydrophobizität nicht mit der Größe des Proteins
korreliert. Doch auch nach der Gelauftrennung kann es vorkommen, dass (wie im Kap. 5.2.1
beschrieben) das geringkonzentrierte Protein wegen der geringen Nachweisgrenze des
Coomassie Blue nicht detektiert werden kann (s. Abb. V.11). Hier müsste dann auf andere
Färbemittel, wie z. B. Silbernitrat, ausgewichen werden, welches allerdings die
Desorption/Ionisation bei der MALDI-TOF-Massenspektrometrie erschweren kann [Lopez et
al., 2000].
Die Sensitivität soll auch als ein weiteres Kriterium beider Trennmethoden dienen. Und sie
spricht in beiden Dimensionen für die PF-2D. In der ersten Dimension lassen sich einfach pH-
Schritte von 0,3 einstellen, die Fraktionen werden entsprechend gesammelt. Und die zweite
Dimension zeigt bei 214 nm kleinste Proteinkonzentrationen im tiefen ng-Bereich an. Der
Sensitivitätsvorteil der PF-2D gilt aber nur im vorliegenden Fall, mit Coomassie Blue als
Färbemittel für die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine. Die Detektionsgrenze von
Coomassie Blue liegt laut Berggren et al. [2000] bei 8-16 ng Protein. Allerdings ist
Coomassie Blue immer noch ein sehr einfach zu handhabendes, ungiftiges und preisgünstiges
Färbemittel, was es trotz seiner geringeren Sensitivität zu einem in allen Laboren eingesetzten
Kolorierungsmittel für Proteinnachweis macht. Zusätzlich erweist es sich als gut kompatibel
zur massenspektrometrischen Analyse am MALDI-TOF-Massenspektrometer.
Vor zehn Jahren erstmalig aufgekommen ist das DIGE („Difference Gel
Electrophoresis“)-Verfahren, welches mit Fluoreszenzfarbstoffen arbeitet [Bergh, 2009;
Timms & Cramer, 2008], die mit der primären Aminogruppe und Lysinen der Proteine
reagieren. Diese Fluoreszenzfarbstoffe weisen ein relativ niedriges Detektionslimit von etwa
1 ng Protein auf, welches selbst Silber oder die SyproRuby-Färbung übertrifft. Mit diesem
Verfahren lassen sich bis zu drei verschiedene Gesamtproteine auf einem Gel verarbeiten,
wenn sie nacheinander von einem entsprechenden Scanner aufgenommen werden. Zudem
kann eine weitere Unzulänglichkeit der Gelelektrophorese ausgemerzt werden: die Gel-
Variabilität. Denn selbst bei parallel gelaufenen Gelen verhalten sich die Proteintrennungen