Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 52
• Bei genügender Reinheit wird das Volumen der Eluate über Ultrafiltrationszellen oder
Zentrifugalfilter eingeengt, um das Protein für Folgeversuche in höheren Konzentrationen
vorliegen zu haben.
• Oder die aufkonzentrierten Proteine werden weiteren Reinigungsverfahren (z. B. der
Gelfiltration) unterzogen.
4.8.2 Behandlung der rekombinanten Proteine mit „PreScission-Protease“
Fusionsproteine, die in Vektoren kloniert wurden, welche hinter dem Fusions-Tag eine
Basenerkennungssequenz für Proteasen aufweisen, sind nach der Expression infolgedessen
mit einer Aminosäuresequenz versehen, die im Fall der hier verwendeten Vektoren von der
viralen 3C-Protease „PreScission-Protein“ erkannt und geschnitten werden kann. Damit kann
man den jeweiligen Histidin- oder GST-Tag eines Fusionsproteins nach der Aufreinigung
entfernen und somit bis auf wenige Aminosäurereste die Sequenz des rekombinant
aufgereinigten Proteins der Sequenz des im original vorkommenden Organismus angleichen.
• Histidin-Fusionsproteine vor der PreScission-Behandlung von der Säule eluieren, die
Fraktionen sammeln (bis 20 ml) und im Eluatpuffer etwa 600 µg Protease einsetzen und
ü/N bei 4 °C aufbewahren.
• GST-Fusionsproteine auf der Säule gebunden belassen und etwa 400 µg Protease in 5 ml
Proteasepuffer (50 mM Tris/HCl, 150 mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, pH 7,0) und
per Spritze langsam in die Säule injizieren; ü/N bei 4 °C inkubieren.
• Um den geschnittenen His-Tag sowie die PreScission-Protease vom Zielprotein zu
trennen, wird das Eluat nach der Inkubation über eine HisTrap FF- und GSTrap FF-Säule
gegeben; der fraktionierte Durchlauf wird gesammelt und aufkonzentriert; stets SDS-
PAGE zur Kontrolle durchführen, danach Konzentrat weiterbearbeiten.
• Der geschnittene GST-Tag und die PreScission-Protease verbleiben gebunden an der
Säule, der Durchlauf mit Proteinpuffer wird wie im His-Tag Fall aufgefangen und
entsprechend weiterverarbeitet.
4.8.3 Proteinaufreinigung mit Hilfe der Größenausschlusschromatographie
Die Größenausschlusschromatographie oder auch Gelfiltration ist eine Anwendung, die die
Proteine oder Moleküle nach deren Größe auftrennt. Das Säulenmaterial besteht dabei aus
einer porösen Matrix, in die die Proteine eindiffundieren können. Kleine Proteine, die in die
Verwindungen eindringen und im Gegensatz zu den großen nicht ungehindert mit der