Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 35
Brutschrank bei 37 °C für ca. 92 Stunden anwachsen und sich die Kolonie-Verbreitung per
„Twitching motility“ vom Inokulierungsring aus feststellen und vergleichen lässt.
4.2 Zellaufschluss und Gesamt- bzw. Rekombinantproteinisolierung
4.2.1 Zellaufschluss und Gesamtproteinisolierung von Legionella-Stämmen
Für die Zellernte wird 15 min bei 4500 U/min und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wird
abgenommen, mit 5 ml eiskaltem Zellwaschpuffer (s. Kap. 3.3.1) resuspendiert und in ein
50 ml Röhrchen zusammengeführt. Erneut 15 min lang zentrifugieren und den Überstand
abgießen und pro 0,5 ml Zellpellet 2 ml Lysepuffer zugeben und langsam per Pipette
durchmischen. Danach zum Aufschluss per Ultraschall die Bakterien 3 mal 30 Sekunden mit
maximaler Amplitude (pulsierend) behandeln, dazwischen je 1 min auf Eis. Die so
bearbeiteten Zellen in Zentrifugenröhrchen geben und per Ultrazentrifuge auf ca. 35000
U/min (etwa 120000 g) für 1 Stunde bei 18 °C abzentrifugieren. Den Überstand zu 1 ml- oder
2 ml-Fraktionen in Eppendorfgefäße verteilen und bei -70 °C bis zur Auftrennung einfrieren.
4.2.2 Zellaufschluss und Isolierung von rekombinanten Fusionsproteinen bei E. coli
Die eingefrorenen Zellpellets werden schonend auf Eis aufgetaut und mit einer Kanüle und
dem passenden Lysepuffer (s. Kap. 3.3.8) je nach verwendetem Vektor resuspendiert. Pro mg
Pellet werden 2-5 ml Lysepuffer genutzt. Die Zellsuspension wird genau wie bei den
Legionellen auf Eis mit Ultraschall mit maximaler Amplitude für 30 s (pulsierend)
aufgebrochen. Das Ganze wird 3-mal wiederholt, mit je einminütigen Pausen dazwischen auf
Eis. Danach wird die Suspension bei 120000 g für 1,5 Std. bei 4 °C zentrifugiert und der
Überstand wird nach 0,45 µm-Filtration langsam (0,5 ml/min) entweder auf eine HisTrap oder
GSTrap-Säule gegeben. Zur weiteren Bearbeitung der rekombinanten Proteine s. Kap. 4.8.1.
4.3 Ein- und zweidimensionale Auftrennung von Proteinen durch SDS-
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Unter einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese versteht man die Bewegung elektrisch
geladener Teilchen im nicht-leitenden Polyacrylamidgel unter dem Einfluss elektrischer