Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 84
werden – die Verhältnismäßigkeit zum gyrA-Gen zeigt sich aber immerzu identisch und fast
gleich, d.h. die CT-Werte beider Gene liegen in jedem Lauf auf etwa gleichem Niveau und
unterscheiden sich nicht mehr als in maximal einem Zyklus.
Folgende Ergebnisse sind zwischen Wildtyp und Mutante in der spätstationären Phase erzielt
worden:
Stamm CT-Werte der stationären Phase
gyrA
pilN
Wildtyp 23,5 23,6 23,8 24,3 Ø 23,8 22,8 22,7 22,7 22,7 Ø 22,7
flaR - -Mutante 22,8 22,9 23,1 23,2 Ø 23,0 22,4 22,4 22,4 22,3 Ø 22,4
Dabei hat die abschließende Schmelzkurven-Analyse gezeigt, dass es bei der
Amplifikatbildung kaum zu Nebenprodukten oder Kreuzreaktionen der Primer gekommen ist
(s. Abb. V.25), die dann ebenfalls zu einer Wellenlängenemission beigetragen und den CT-
Wert hätten verfälschen können.
Abb. V.25 Schmelzkurven nach Abschluss der
Amplifikation. Zu sehen ist die Reporterfarbstoff-
Emission bei unterschiedlichen Temperaturen. Über
einen Zeitraum von 30 min wird von 60 °C auf
95 °C hochgeregelt und alle 0,5 °C die abnehmende
Fluoreszenz gemessen. Präsentiert wird die
Übersicht aber in derivatisierter Form, um ein
anschauliches Diagramm zu erhalten. Die zwei
Schmelzkurven geben den Zerfall der zwei
gebildeten Amplifikate (pilN und gyrA) wieder.
Somit ist es zu keinen anderen Nebenprodukten
oder Dimerbildungen der Primer gekommen, die
fälschlicherweise für einen Anstieg an
Lichtemission gesorgt hätten. Die Schmelzkurven-
Analyse dient also als Nachweis der Spezifität des
Fluoreszenzfarbstoffes SYBR ® green.
Die Unterschiede zwischen Wildtyp und flaR - in der pilN-Expression sind demnach zu
marginal. Das hier gezeigte Ergebnis offenbarte sich aber nicht bei allen Versuchen, doch
haben sich die einzelnen Versuche zu unbeständig gezeigt, als dass von einer tatsächlichen
Verminderung der pilN-Expression in der flaR - -Mutante gesprochen werden könnte.