Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Diskussion 102
6.4 Diffraktionsdatensammlung vom PilN-Kristall
Der am besten streuende Kristall ist im sog. „sitting drop“-Verfahren mit 0,1 M Natriumcitrat,
0,1 M Tris pH 8,0, 20 %(v/v) Isopropanol und 1,5 %(v/v) Glycerin als Reservoirlösung
erzeugt worden. Bis zum Erreichen des maximalen Volumens von 0,4 x 0,05 x 0,05 mm 3 des
hier verwendeten Kristalls vergingen etwa 2-3 Monate. Für jedes Diffraktionsbild wurde der
Kristall am Synchrotron (kryogene Bedingungen s. Kap. 4.9.3) bei einer Expositionszeit von
30 Sekunden um 0,5° gedreht. Dabei sind im Ganzen 100 Beugungsbilder aufgenommen
worden.
6.4.1 Vorläufige kristallographische Charakterisierung
Die detektierten Reflexe wurden mit dem Programm MOSFLM prozessiert, skaliert worden
ist mit der Software SCALA, welches im Softwarepaket CCP4 integriert ist. Die ermittelten
Datenstatistiken sind in Kap. 5.4.2 tabelliert. Insgesamt sind 22827 Intensitäten gemessen
worden, die 3239 einzigartige Reflexe mit einem R merge -Faktor von 6,2 % ergeben haben.
Beim Zusammenfügen aller Datenbilder hat sich eine Vollständigkeit von ca. 97 % ergeben.
Die Analyse der erhaltenen Diffraktionsdaten führte zur Einordnung in das hexagonale
Kristallsystem mit den Einheitszellparametern a = b = 85,96 Å und c = 85,67 Å. Die
Auswertung mit dem Programm POINTLESS (v1.3.9) [Evans, 2006] deutete auf die
Raumgruppe P622 hin.
Die anschließende Berechnung des Matthews-Koeffizienten [Matthews, 1968], der das
Volumen des kristallisierten Proteins (samt Solvens) pro Dalton in der asymmetrischen Zelle
angibt, ergab für ein Proteinmolekül pro asymmetrischer Einheit einen V M -Wert von
2,62 Å 3 /Da. Das würde einem Wassergehalt von 53,1 % entsprechen. Berechnungen für zwei
Proteinmoleküle lieferten einen weniger wahrscheinlichen V M -Wert von 1,31 Å 3 /Da. Aus der
Häufigkeitsverteilung aller in der Proteindatenbank (PDB) bis November 2002 hinterlegten
Proteinkristalle lässt sich schlussfolgern, dass vermutlich nur ein Proteinmolekül pro
asymmetrischer Zelle vorliegt [Kantardjieff & Rupp, 2003]. Ein Widerspruch zu den
Ergebnissen der Gelfiltration, die einen Oligomerisierungsgrad von zwei homologen
Proteinmolekülen vermuten ließen (s. auch Kap. 5.3.2), ergibt sich hieraus nicht
notwendigerweise. Denn womöglich kann in der finalen Kristallstruktur eine
Homodimerisierung durch eine der kristallographischen Zweifachachsen beobachtet werden.
Potentielle Suchmodelle zur Phasierung mittels molekularen Ersatzes (MR) wurden
mit Hilfe des Programms PHYRE [Kelley & Sternberg, 2009] analysiert, welches basierend