Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 50
• Das Gel wird kurz im Kathodenpuffer inkubiert und die Blotpapiere aus dem
Anodenpuffer auf die Anode der Blotapparatur gelegt, die Transfer-Membran liegt oben
luftblasenfrei auf.
• Auf die Membran wird ohne Lufteinschlüsse das Gel passend aufgelegt und mit den 3
Blotpapieren des Kathodenpuffers abgedeckt.
• Mit leichtem Druck wird mit einer Glaspipette der Aufbau zusammengerollt, die
Kathodenseite eingehängt und angeschlossen und die Elektrophorese mit 42 mA/Gel für
50 min gestartet.
• Nach Ende des Transfers wird die Membran reversibel mit Ponceau-Rot gefärbt, um den
Transfer begutachten und dokumentieren zu können; mit Waschpuffer entfärben.
4.7.2 Immunodetektion mit primärem und sekundärem Antikörper
Der sekundäre Antikörper ist mit dem Enzym alkalische Phosphatase konjugiert. Das Enzym
katalysiert eine Vielzahl an Phosphatestern unter basischen Bedingungen. Um die Reaktion
sichtbar zu machen und damit den sekundären Antikörper lokalisieren zu können, kommen
etliche Farbstoffe zum Einsatz. Die Detektion der Phosphatase verläuft über die Reduktion
des Tetrazoliumsalzes (NBT) hin zum Diformazan; als Elektronenüberträger dient dabei das
von der Phosphatase umgesetzte Indoxylphosphat (BCIP) hin zum Dimer Indigoblau. Beide
Stoffe sind umgesetzt als Farbstoffe sichtbar; die Methode ist abgeleitet von Blake et al.
[1984].
• Die Nitrocellulose-Membran 1 Std. in Blockpuffer schütteln, danach 3-mal 10 min mit
Waschpuffer waschen.
• Primärer Antikörper (entweder Anti-Histidin oder Anti-GST) in entsprechender
Verdünnung (s. Kap. 3.3.6) in Waschpuffer für 1,5 Std. aufbringen und schütteln lassen,
danach mit Waschpuffer 3 mal 10 min waschen.
• Den sekundären Antikörper (entweder Anti-Kaninchen oder Anti-Maus) in 1:10000
Verdünnung in Waschpuffer für 1 Std. einwirken lassen, danach die Membran erneut
waschen.
• Die Transfer-Membran für 5 min im alkalischen Phosphatasepuffer inkubieren lassen.
• Färbelösung auf die Membran bringen und solange einwirken lassen, bis die
Proteinbanden optimal zur Geltung kommen.