Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 48
anschließende Ligation verläuft hier wie schon in Kap. 4.5.3 beschrieben. Zur Überprüfung
wird immer eine nachfolgende Enzymbehandlung mit anschließender Geltrennung
durchgeführt. Zeigt sich das Ergebnis des Gelbildes positiv, wird der Ligationsansatz für die
Transformation (s. Kap. 4.5.3) in einen recA1- und endA1-negativen Stamm genutzt (s. Kap.
3.1.6), um eine Dauerkultur anlegen und eine Plasmid-DNA Isolierung durchführen zu
können.
Nach der Plasmid-Isolierung wird der Vektor zur Sequenzierung verschickt, um Rasterfehler,
Nukleotidaustausch und korrekte Leserichtung kontrollieren zu können. Im letzten Schritt
wird der neu ligierte Vektor in einen bakteriellen Expressionsstamm transformiert und die
Testexpression des rekombinanten Proteins gestartet.
4.6.6 Real-Time-PCR
Die Nukleinsäure-Vervielfältigung durch Real-Time-PCR (RT-PCR) beruht auf dem gleichen
Prinzip wie dem der herkömmlichen Polymerasen-Ketten-Reaktion. Die RT-PCR bietet aber
zusätzlich die Möglichkeit, Aussagen über die Quantifizierung oder vergleichende Analysen
zweier untersuchter Gene zu treffen und dank der Fluoreszenzfarbstoffe auch in Echtzeit und
nicht erst am Ende des Laufes. Die Fluoreszenz nimmt dabei proportional mit der Menge an
Amplifikat zu, wodurch die Quantifizierung oder Semiquantifizierung möglich wird.
In der vorliegenden Arbeit sind zwei verschiedene Gene (gyrA, pilN) untersucht und deren
mRNA-Ausgangsmaterial zueinander und in verschiedenen Stämmen in Relation gesetzt
worden. Es wurde der Legionella-Wildtyp und die flaR - -Mutante untersucht. Dazu ist die
Gesamt-RNA des Wildtyps und der Mutante isoliert worden. Die mRNA der beiden Gene
gyrA und pilN ist in beiden Stämmen in sog. cDNA umgewandelt und als DNA-Matrize für
die Vervielfältigung benutzt worden. Anhand der Fluoreszenzwerte können dann
Rückschlüsse auf das mRNA-Expressionslevel der beiden Gene in den Stämmen gezogen
werden.
Als Fluoreszenzfarbstoff ist SYBR ® Green zum Einsatz gekommen. Er lagert sich in die
kleine Furche doppelsträngiger DNA und beginnt erst dann zu fluoreszieren.
Die Isolierung der RNA ist nach Herstellerangeben des High Pure RNA Isolation Kit
durchgeführt worden. Aufbewahrt wird die Gesamt-RNA bei -70 °C.
Synthese der cDNA:
• Ca. 800 ng Gesamt-RNA, 1,5 µl Rückwärtsprimer (3 pmol/µl) sowie 2 µl Randomprimer
mit 2 µl 10-fach Puffer zusammengeben.