Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 40
Die zweite Dimension wird mit Hilfe einer Reversphasen-Chromatographie-Säule
vollzogen. Die stationäre Phase der Säule ist hierbei nicht polar, die polare flüssige enthält ein
„ion-supressing“-Agens (tri-Fluoressigsäure, TFA) und variiert in der Konzentration der
organischen Lösung. Dieser ebenfalls über einen Gradienten ansteigende organische
Lösungsmittelanteil, hier Acetonitril, desorbiert die Proteine von der Säule. Je höher dabei die
Anteile von nicht-polaren Aminosäuren im Protein sind, desto größer muss der Anteil von
organischem Lösungsmittel sein, um das Protein von der hydrophoben Seite der Säule zu
lösen. Ein ebenfalls angeschlossener Fraktionskollektor sammelt die entsprechenden Protein-
Fraktionen.
4.4.1 Erste Dimension, Proteintrennung nach IEP
Mit Vorliegen des Gesamtproteinisolates verfährt man weiter wie folgt:
• Das Proteinisolat wird über eine vorab mit Startpuffer A (s. Kap. 3.3.3) equilibrierte PD-
10 Säule (Beckman Coulter) entsalzt.
• Konzentration auf ca. 3,5 mg Protein/2,5 ml Volumen mit Startpuffer A einstellen 2 .
• An der PF-2D-Anlage pH-Meter und UV-Lampen kalibrieren, alle Puffer anschließen und
spülen, Säulen equilibrieren und vorbereiten.
• Den Software-betriebenen Methodenablauf kontrollieren, starten und 2,5 ml des
Proteinisolates per Spritze über den Loop-Injektor (2,5 ml Fassungsvolumen) unter Fluss
(0,2 ml/min) injizieren.
• Nach 130 min die gesammelten Proteinfraktionen in der Mikrotiterplatte entweder bei
-70 °C lagern oder vorzugsweise direkt die 2. Dimension anschließen.
4.4.2 Zweite Dimension, Auftrennung durch Reversphasen-Chromatographie
Im normalen Betrieb ist für die Auftrennung in der zweiten Dimension ein linearer
Acetonitril-Gradient über eine Zeit von 45 min bei einem Fluss von 0,75 ml/min vorgesehen.
Das hier genutzte Verfahren ist eine modifizierte Methode von Zheng et al. [2003].
2 Zur Feststellung der Konzentration wird die Absorption der Probe bei einer Wellenlänge von 280 nm
gemessen; als Referenz dient der Startpuffer A. Nach Pace et al. [1995] lässt sich mit dem Durchschnittswert von
0,769 mg/ml multipliziert mit dem Absorptionswert 280 die Konzentration errechnen, ohne auf die üblichen
kolorimetrischen Verfahren zurückgreifen zu müssen.