Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 79
ein Durchschnittswert für PilN von 27,5 kDa ermittelt worden. Dieser Wert tendiert dabei
eher zum PilN-Dimer (34,8 kDa) als zum Monomer, wenngleich die rechnerisch ermittelte
Molekularmasse nicht mit der tatsächlichen übereinstimmt. Das Gleiche gilt allerdings auch
für die benutzten Kalibrierproteine oder -peptide, deren Werte auch oftmals voneinander
abweichen.
Für die PilN-Proteine, die kodiert in den Vektoren mit Protease-Spaltsequenz
vorgelegen haben, ergab sich in allen Aufreinigungsschritten ein ähnlich reines Bild;
wenngleich die Ausbeute in der Proteingewinnung hier deutlich geringer ausgefallen ist.
Damit einhergehend ist es zu einer geringeren Konzentration für PilN mit dem abgespaltenen
Histidin-Fusionsrest (s. Abb. V.21) von etwa 5 mg/ml gekommen. PilN, welches fusioniert
mit dem Protein GST vorgelegen hat, konnte trotz mehrfacher Versuche mit
verschiedenartigen Puffern sowohl auf der Säule als auch im eluierten Zustand nicht vom
GST-Tag getrennt werden. Dabei haben die in Auftrag gegebenen Sequenzierungen der fertig
gestellten Expressionsvektoren die Schnittstelle für die PreScission-Protease bestätigt.
Möglicherweise kommt es hier zu einer sterischen Hinderung durch Wechselwirkung vom
GST-Tag mit dem PilN-Protein, so dass die Protease die Schnittsequenz nicht mehr
erreicht/erkennt.
Abb. V.21 SDS-PAGE vom PilN-Protein ohne vorhergesagte TMH-Region. Der schwarze
Pfeil markiert das Protein mit Histidin-Fusionsrest (18,6 kDa), der rote Pfeil deutet auf
PilN ohne die Histidinreste nach der PreScisson-Behandlung (16,5 kDa).
Proteinfärbemittel ist auch hier Coomassie Blue.
5.4 Kristallisation und Diffraktion des rekombinanten und verkürzten
Proteins PilN
Für die Kristallisation sind lediglich die verkürzten PilN-Proteine, ohne die computergestützt
vorhergesagte TMH- oder Membrananker-Region genutzt worden. Dazu wurden hier zum