Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Methoden 39
4.3.4 Färben und Entfärben der Proteine mit Coomassie Blue
Coomassie Brillant Blue besteht aus 45 Kohlenstoffatomen (Molare Masse von Coomassie
Blue R-250: 825,97 g/mol) und ist ein synthetischer, heterocyclischer, organischer Farbstoff –
ein Diammonium-Salz. Coomassie Blue geht hydrophobe Wechselwirkungen mit
denaturierten Proteinen ein, lagert sich an die basischen Seitenketten der Aminosäuren an und
färbt das Protein blau.
• Gele für 45 min in Fixierlösung bewegen.
• Coomassie Blue-Färbelösung (s. Kap. 3.3.5) für ca. 1 Std. oder ü/N einwirken lassen.
• Mit Entfärberlösung und ggf. 7%iger Essigsäure für 2-3 Std. entfärben.
• In ddH 2 O bewegen lassen, bis der Gelhintergrund völlig entfärbt ist.
4.4 Proteinfraktionierung in der HPLC PF-2D
Die ProteomeLab TM PF-2D Einheit trennt in der ersten Dimension mittels einer HPCF-Säule,
die als Ionenaustauscher arbeitet, die Proteine ebenfalls nach isoelektrischem Punkt. Innerhalb
der Säule bleiben am anfänglich herrschenden pH-Wert von ca. 8,8 des Startpuffers A negativ
geladene Proteine an der positiv geladenen stationären Phase hängen. Positiv geladene
hingegen werden abgestoßen. Der einfließende Eluentpuffer B etabliert über einen
festgelegten Zeitraum einen pH-Gradienten bis hin zum pH-Wert 4,0. Während des
Gradientenaufbaus bewegen sich alle Proteine innerhalb der Säule entsprechend ihrer vom
Gradienten angenommenen Ladung und fließen gemäß ihres IEP ungeladen oder positiv
geladen aus der Säule.
Zur Verdeutlichung:
Ist der pH-Wert im Umgebungsmilieu der Säule größer als der IEP des Proteins, ist die
Protein-Nettoladung negativ – das Protein bindet an die polare Säulenmatrix.
Ist der pH-Wert im Umgebungsmilieu der Säule gleich dem IEP des Proteins, ist die Protein-
Nettoladung null – das Protein liegt in der Lösung vor.
Zeigt sich der pH-Wert im Umgebungsmilieu der Säule kleiner als der IEP des Proteins, wird
die Protein-Nettoladung positiv – das Protein wird von der polaren Säulenmatrix abgestoßen.
Der an die HPCF-Säule angeschlossene Fraktionskollektor sammelt die eluierten
Proteine in einer 96er-Mikrotiterplatte in pH-Schritten von jeweils 0,3 pH-Werten.