Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Inhaltsverzeichnis
II
3.3.4 Lösungen für MALDI-TOF-Massenspektrometrie............................................................................ 31
3.3.5 Lösungen für Protein-Färbungen ....................................................................................................... 31
3.3.6 Lösungen und Puffer für Westernblot und Immunodetektion............................................................ 31
3.3.7 Lösungen und Puffer für die PCR und die RT-PCR .......................................................................... 32
3.3.8 Puffer für die Aufreinigung rekombinanter Proteine an einer FPLC ................................................. 32
IV METHODEN .................................................................................................. 34
4.1 Bakterienkultivierung und –anzucht .................................................................................................. 34
4.1.1 Anzucht von bakteriellen Stämmen und deren Konservierung.......................................................... 34
4.1.2 „Twitching motility“-Tests bei Legionella pneumophila Corby........................................................ 34
4.2 Zellaufschluss und Gesamt- bzw. Rekombinantproteinisolierung ................................................... 35
4.2.1 Zellaufschluss und Gesamtproteinisolierung von Legionella-Stämmen ............................................ 35
4.2.2 Zellaufschluss und Isolierung von rekombinanten Fusionsproteinen bei E. coli ............................... 35
4.3 Ein- und zweidimensionale Auftrennung von Proteinen durch SDS-PAGE................................... 35
4.3.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese...................................................................................................... 37
4.3.2 Erste Dimension, Isoelektrische Fokussierung .................................................................................. 37
4.3.3 Zweite Dimension, Auftrennung nach Molekulargewicht ................................................................. 38
4.3.4 Färben und Entfärben der Proteine mit Coomassie Blue ................................................................... 39
4.4 Proteinfraktionierung in der HPLC PF-2D........................................................................................ 39
4.4.1 Erste Dimension, Proteintrennung nach IEP...................................................................................... 40
4.4.2 Zweite Dimension, Auftrennung durch Reversphasen-Chromatographie ......................................... 40
4.5 Proteinidentifizierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie-Analyse ................................. 41
4.5.1 Tryptischer Verdau ............................................................................................................................ 42
4.5.2 Beladung und Bedienung des MALDI-TOF-Massenspektrometers .................................................. 43
4.5.3 Massenspektren-Analysen via Software ............................................................................................43
4.6 PCR- und genetische Klonierungsarbeiten......................................................................................... 44
4.6.1 Amplifikation und Klonierung von Legionella-Genen ...................................................................... 45
4.6.2 Ligation mittels des pGEM-T Easy Vektors...................................................................................... 45
4.6.3 Plasmid-DNA-Isolierung ................................................................................................................... 46
4.6.4 Transformation der E. coli-Stämme durch Hitzeschock .................................................................... 47
4.6.5 Restriktionsenzymbehandlung und Ligation in die Expressionsvektoren pQE und pGEX ............... 47
4.6.6 Real-Time-PCR.................................................................................................................................. 48
4.7 Semi-Trocken-Elektroblotting (Westernblot) .................................................................................... 49
4.7.1 Proteintransfer auf eine Nitrocellulose-Membran.............................................................................. 49
4.7.2 Immunodetektion mit primärem und sekundärem Antikörper........................................................... 50