Identifizierung und Charakterisierung von potentiellen ...

Ergebnisse 66
5.2 Übersicht der zweidimensionalen Auftrennung in der HPCF (PF-2D)
Neben der Technik der 2D-Gelelektrophorese zur Auftrennung und Identifikation putativer
Virulenzfaktoren ist noch die Hochdruckchromatographie zum Einsatz gekommen. Das
Proteinfraktionierungssystem 2D (PF-2D) trennt in der ersten Dimension mittels einer „High
Pressure Chromatofocusing“-(HPCF) Säule, die als Ionenaustauscher arbeitet, die Proteine –
wie bei der 2D-Gelelektrophorese – nach ihrem isoelektrischen Punkt. Die direkt an die erste
Dimension angeschlossene zweite Dimension wird mit Hilfe einer Reversphasen-
Chromatographiesäule vollzogen und trennt unter Hochdruck die Proteine nach
Hydrophobizität. Nicht die stationäre Phase der Säule ist hierbei polar (im Gegensatz zur
ersten Dimension), sondern die mobile, organische Phase. Daher stammt der Name der
Reversphasen-Chromatographie. Beide Dimensionen trennen das injizierte Gesamtzellprotein
über einen jeweiligen Flüssiggradienten auf. Dieses Arbeiten in der Flüssigphase mit allen
Proteinen, das Auftrennungsprinzip der zweiten Dimension und die Detektion der Proteine
über UV-Absorption unterscheidet das PF-2D-System von der 2D-Gelelektrophorese.
Proteomanalysen durch die PF-2D wurden vom Wildtyp und den flaR - - und fliA - -Mutanten
durchgeführt. L. hackeliae wurde wegen seiner immensen Differenzen im Proteinmuster in
diesem Fall nicht zur Untersuchung herangezogen.
Anzucht (Kap. 4.1.1) und Zellaufschluss (Kap. 4.2.1) der Legionellen werden wie
dokumentiert gehandhabt. Der Ablauf der Proteinisolierung verläuft genau wie bei der
Isolierung zur 2D-PAGE. Lediglich kurz vor dem Start der Fokussierung unterscheiden sich
die zu benutzenden Puffersysteme. Injiziert werden in die Injektor-Aufnahme der ersten
Dimension ca. 3,5 mg Gesamtprotein in einem Volumen von 2,5 ml.
5.2.1 Expressionsunterschiede der flaR - - und fliA - -Mutante im Vergleich zum Wildtyp
Wenngleich auch die erste Dimension per UV-Absorption bei 280 nm überwacht wird, sind
hier selten relevante, große Unterschiede in den verschiedenen Profilen auszumachen (s. Abb.
V.8). Das liegt einerseits an der Aufnahme bei 280 nm (in der zweiten Dimension wird bei
214 nm detektiert), andererseits auch am System selbst: so zeigt sich kein Lauf wirklich
redundant; die Fraktionen, die nach pH-Werten zusammengestellt werden, sind stets leicht
verschieden, von Lauf zu Lauf sind also immer kleine Abweichungen in der ersten Dimension
mit einzukalkulieren.